Xác định nhiệt độ tối ưu: Chúng tôi tiến hành phản ứng enzyme-cơ chất ở các nhiệt độ từ 30-80°C trong 1 giờ ở pH 5,0. Kết quả phân tích hoạt tính cho thấy ở pH 5,0 nhiệt độ tối ưu cho phản ứng enzyme-cơ chất là 60°C (hình 3.14)
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên phản ứng enzyme-cơ chất ở pH 5,0 Hoạt tính enzyme tăng dần khi ủ enzyme-cơ chất từ 30-60°C và đạt cực đại ở 60°C. Coi hoạt tính tại 60°C là 100% thì ở 50°C hoạt tính enzyme cũng khá tốt đạt 94,2% so với hoạt tính ở nhiệt độ tối ưu. Tại nhiệt độ 70°C hoạt tính enzyme bắt đầu giảm và giảm mạnh nhất khi ủ phản ứng tại 80°C. Tại đây hoạt tính enzyme chỉ còn 13,92% so với hoạt tính ở 60°C. Như vậy ở pH 5,0; nhiệt độ tối ưu cho phản ứng enzyme cơ chất của enzyme tinh chế được là 60°C.
Xác định độ bền nhiệt của enzyme tinh sạch được: Chúng tôi ủ enzyme ở các nhiệt độ khác nhau: 0; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90 và 99°C trong 10 phút pH 5,0 sau đó giữ enzyme trong ngăn mát tủ lạnh để hôm sau phân tích. Sau quá trình phân tích, kết quả chúng tôi thu được: ở 0°C là nhiệt độ bảo quản enzyme, enzyme cho hoạt tính cao nhất. Khi ủ các enzyme ở nhiệt độ từ 30-60°C trong 10 phút, hoạt tính của enzyme vẫn giữ được trên 80%. Nhưng khi tăng lên 70°C, hoạt tính enzyme giảm mạnh, enzyme chỉ còn giữ được 5% so với hoạt tính ở nhiệt độ bảo quản
0 20 40 60 80 100 120 20 30 40 50 60 70 80 90 Hoạt t ín h , % Nhiệt độ
enzyme. Ở các nhiệt độ cao hơn 80; 90; 99°C enzyme hoàn toàn bị mất hoạt tính (hình 3.14). Như vậy enzyme bền với nhiệt độ 60°C trong vòng 10 phút.
Hình 3.15. Độ bền nhiệt của enzyme ở pH 5,0
Chúng tôi tiếp tục khảo sát độ bền nhiệt của enzyme ở 60°C, pH 5 ở các khoảng thời gian khác nhau. Enzyme sẽ được ủ ở nhiệt độ 60°C trong 0; 10; 20; 30; 60; 90; 120; 150 và 180 phút.
Hình 3.16. Độ bền nhiệt của enzyme ở 60°C, pH 5,0 theo thời gian 0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Hoạt t ín h , % Nhiệt độ 0 20 40 60 80 100 120 0 30 60 90 120 150 180 210 Hoạt t ín h , % Thời gian, phút
Enzyme sau khi ủ ở 60°C trong 3 giờ hoạt tính enzyme vẫn giữ được gần 70% hoạt tính so với hoạt tính của enzyme khi ủ trong 0 phút. Sau khoảng thời gian 30 phút hoạt tính enzyme vẫn giữ được trên 80%. Ở các khoảng thời gian khác nhau từ 30-180 phút hoạt tính enzyme có giảm theo thời gian nhưng độ giảm không đáng kể (hình 3.15). Như vậy enzyme tinh chế được bền ở 60°C trong vòng 3 giờ ở pH 5,0.
3.8. Xác định pH tối ƣu của enzyme tinh sạch đƣợc
Chúng tôi xác định ảnh hưởng của các độ pH khác nhau lên phản ứng giữa enzyme và cơ chất. Các pH thí nghiệm là 2,5; 3,5; 4; 5; 6 sử dụng đệm Natri-citrate 0,05 M để đưa phản ứng về các pH mong muốn. Phản ứng được thực hiện ở 50°C trong 1 giờ.
Hình 3. 17. Ảnh hưởng của pH lên phản ứng enzyme cơ chất ở 50°C
Enzyme có pH tối ưu tại 4 ở 50°C, ở pH 3,5 và pH 5,0 enzyme vẫn có 69,7% và 64% hoạt tính so với ở pH 4,0. Ở pH 2,5 enzyme không có hoạt tính. Ở pH 6 hoạt tính enzyme thấp chỉ đạt lần lượt 37% so với hoạt tính ở pH 4,0 (hình 3.17).
0 20 40 60 80 100 120 2 3 4 5 6 7 Hoạt t ín h , % pH
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Từ 30 mẫu thu thập trên các địa bàn Hà Nội, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Nguyên, Đắc Lắc đã phân lập được 62 chủng nấm mốc có khả năng phát triển ở pH thấp.
2. Bằng kỹ thuật PCR fingerprinting xác lập được 35 nhóm từ 62 chủng nấm mốc đã phân lập và định tên tới loài 33 chủng bằng giải trình tự 18S rDNA. 3. Đánh giá độ bền nhiệt và khả năng hoạt động ở pH thấp của enzyme
cellulase từ 62 chủng đã phân lập. Từ đây chọn được enzyme cellulase từ chủng
Penicillum verruculosum đáp ứng được mục tiêu đề tài.
4. Cellulase tinh chế được từ chủng P. verruculosum có kích thước khoảng 45 kDa, hoạt động tối ưu ở pH 4,0 và 60°C. Enzyme này có khả năng bền nhiệt ở 60°C trong 3 giờ.
KIẾN NGHỊ
Do giới hạn về thời gian nên những nghiên cứu về việc tìm kiếm enzyme cellulase bền nhiệt, hoạt động ở pH thấp vẫn chưa được trọn vẹn, tôi hy vọng có thể tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để giải quyết một số vấn đề sau đây:
- Định tên 3 chủng nấm mốc còn lại
- Phân lập thêm được nhiều chủng nấm mốc chịu pH khác lạ so với những chủng đã công bố
- Tinh sạch được những cellulase còn lại trong hệ cellulase của Penicillium verrucolosum để tìm được enzyme bền nhiệt, hoạt động ở pH thấp nhằm ứng dụng trong chăn nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Ngọc Bích (2003), Kỹ thuật cellulose và giấy, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1985), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật tập 3. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục.
4. Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2007), “ Tinh sạch sơ bộ và đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ chủng Penicillium sp.DTQ-HK1”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 5 (I), tr. 47-54.
5. Hồ Sĩ Tráng (2003), Cơ sở hoá học gỗ và cellulose, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
6. Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lê Doãn Diên (2005), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.153.
Tài liệu tiếng Anh
7. Aehle W. (2007), Enzyme in industry, 3th edited, pp.36-49.
8. Ali S., Hall J., Soole K. L. et al.(1995), “ Targeted expression of microbial cellulases in transgenic animals,” in Carbohydrate Bioengineering, S. B. Petersen, B. Svensson, and S. Pedersen, Eds., vol. 10 of Progress in Biotechnology, pp. 279-293, Elsevier, Amsterdam, The Netherlands.
9. Austen D. E. G, Cartwright T., Dickerson C. H. (1983), Vox S, 44, pp. 151- 155
10. Balci F., Dikmen S., Gencoglu H., Orman A., Turkmen II, Biricik H. (2007), “ The effect of fibrolytic exogenous enzyme on fattening performance of steers, Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 10(2), pp. 113-118.
11. Bhat M. K. (2000), “Cellulases and related enzymes in biotechnology”,
Biotechnology Advances, vol. 18, no. 5, pp. 355–383.
12. Bijender K. B., Himani P., Masood A. W., Priyanka S., Ajay S. (2009), “ Partial purification and characterization of a highly thermostable and pH stable endoglucanase from a new isolated Bacillus strain M-9”, Indian Journal of Chemical Technology, 16, pp. 382-387.
13. Bingze X., Ulf H., Bo E. and Jan-Christer J. (2000), “Purification, characterization and amino-acid sequence analysis of a thermostable, low molecular mass endo-β-1,4-glucanase from blue mussel, Mytilus edulis”,
European Journal Biochemistry, (267), pp. 4970-4977.
14. Boraston A., Bray M, Brun E., Creagh A. L., Gilkes N. R., Guarna M. M., Jervis E., Johnson P., Kormos J., McIntosh L. (1997), “ The structure and function of cellulose-blinding domains”. In: Claeyssens M., Nerinckx W, Piens K. (eds) Tricel 97, “ Carbohydrases from Genetics and Properties of Cellulases 19 Trichoderma reesei and other microoganisms”, Ghent Belgium, Cambridge, UK, pp: 139.
15. Boyce A., Walsh G. (2007), “Production, purification and application- relevant characterization of an endo-1,3(4)-beta-glucanase from Rhizomucor miehei”, Applied Microbiology and biotechnology 76(4), pp. 835-841.
16. Cave I. D., Walker J. C. F., “Stiffness of wood in fast-grown plantation softwoods: the influence of microfibril angle”, Forest Products Journal, 44 (5), pp. 43-48.
17. Charles E. W. (1996), Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, pp 119-285.
18. Cosgrove D. J., Bedinger P., Durachko D. M (1997), Processdings of National Academy os Sciences, USA, 94, pp. 6559.
19. David N. S. Hon (1994), “ Cellulose: a radom walk along its historical path”,
20. Dhiman T. R., Zaman M. S., Gimenez R. R., Walters J. L., Treacher R. (2002), “Performance of dairy cows fed forage treated with fibrolytic enzymes prior to feeding” , Animal Feed Science and Technology, 101(1-4), pp. 115–125.
21. Duan C. J., Xian L., Zhao G. C., Feng Y., Pang H., Bai X. L., Tang J. L., Ma Q. S. and Feng J. X. (2009), “Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens”,
Journal of Applied Microbiology, 107, pp. 245–256.
22. Eero Sjöström (1981), Wood Chemistry.
23. Eveline Q. P. T., Marciano R. R., Thiago M. Mello S., Gilvan C. D., Fabrícia P. F., Edivaldo X. F. F., Cynthia M. K., Ildinete S. P., and Marcio J. P. F. (2013), “An Acidic Thermostable Recombinant Aspergillus nidulans
Endoglucanase Is Active towards Distinct Agriculture Residues”, Enzyme Research, 2013, pp. 1-10.
24. Gama F. M., Mota M. (1997), “ Enzymatic hydrolytic of cellulose (I): relationship between kinetics and physic-chemical parameters”, Biocatal Biotransform, 15, pp. 221-236.
25. Gama F. M., Teixeira J. A., Mota M. (1994), “ Cellulose morphology and enzymatic reactivity: a modified solute exclusion technique”, Biotechonol Bioeng, 43, pp. 381-387.
26. Garleb K. A., Borquin L. D (1991), “Isolation and chemical analysis of nonfermented fiber fractions of oat hulls and cottonseed hulls”, Journal of Animal Science, 69, pp. 1255-1271.
27. Gaudin C., Be’lai¨ch A., Champ S., Be’lai¨ch J.P. (2000), “CeLE, a multidomain cellulose from Clostridium cellulolyticum: a key enzyme in the cellulosome?”, Journal of Bacteriology, 182, pp. 1910-1915.
28. Gelhaye E., Petitdemange H., Gay R. (1993), “Adhesion and growth rate of Clostridium cellulolyticum ATCC 35319 on crystalline cellulose”, Journal of Bacteriology, 175, pp. 3452-3458.
29. Godfrey T. and West S. (1996.), “Textiles”, Industrial Enzymology, pp. 360–371, Macmillan Press, London, UK, 2nd edition.
30. Graham H. and Alnave D. B (1995), “Dietary enzymes for increasing energy availability,” in Biotechnology in Animal Feeds and Animal Feedings, R. J. Wallace and A. Chesson, Eds., pp. 296–309, VHC, Weinheim, Germany. 31. Hreggvidsson G., Kaiste E., Holst O., Eggertsson G., Palsdottir A. and
Kristjansson JK. (1996), “An Extremely Thermostable Cellulase from the Thermophilic Eubacterium Rhodothermus marinus”, Applied Environmental Microbiology, 62 (8), pp. 3047–3049.
32. James W. L, 2012, Advanced Biofuels and Bioproduct, pp. 344-350.
33. Jantaporn T. and Haruyuki I. (2009), “:Thermal stability of Cryptococcus sp. S-2 carboxymethyl cellulase (CSCMCase) having a cellulose binding domain from a fungal exoglucanase: Comparison to recombinant CSCMCase”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 31 (4), pp. 361-365.
34. Karmakar M. and Ray R. R. (2011), “Current trends in research and application of microbial cellulases”, Research Journal of Microbiology, vol. 6, no. 1, pp. 41-53.
35. Kraulis P. J., Clore G. M., Nilges M., Jones T. A., Pettersson G., Knowles J., Gronenborn A. (1989), Biochemistry, 28, pp. 7241.
36. Kuhad R. C, Gupta R., Singh A. (2011), “ Microbial Cellulase and Their Industrial Application”, Enzyme Research, pp. 1-10.
37. Lamed R., Bayer E. A. (1988), “The cellulosome of Clostridium thermocellum”, Advances in Applied Microbiology, 33, pp, 1-46.
38. Lamed R., Setter E., Bayer E. A. (1983), “Characterization of a cellulose- binding, cellulase-containing complex in Clostridium thermocellum”,
Journal of Bacteriology, 156, pp. 828-836.
39. Lamothe L. F., Gidenne T., Debray L., and Chalaye F. (2001), “Intake regulation, performances and health status according to feeding strategy
around weaning ,” in Proceedings of the Second Meeting of COST 848 Working Group 4, pp. 40–41.
40. Lewis G. E., Hunt C. W., Sanch W. K., Treacher R., Pritchard G. T., and Feng P. (1996), “Effect of direct-fed fibrolytic enzymes on the digestive characteristics of a forage-based diet fed to beef steers”, Journal of Animal Science, vol. 74, no.12, pp. 3020–3028.
41. Marli C. , Luciano R. D. B. , Nicole T. S. , Jürgen A. and Aldo J. P. D. (2004), “Characterization of the Cellulase Complex of Penicillium echinulatum”, Biocatalysis and Biotransformation, 22 (5/6), pp. 391-396. 42. Mattock P., Aitchison G. F. (1982), EP 82/30 15, pp.706.
43. Mechaly A., Fierobe H. P., Belaich A., Belaich J. P., Lamed R., Shoham Y., Bayer E. A. (2001), “Cohesin-dockerin interaction in cellulosome assembly. A single hydroxyl group of a dockerin domain distinguishes between nonrecognition and high affinity recognition”, Journal of Biological Chemistry, 276(22), pp. 19678-19678.
44. Naika G. S., Kaul P., Prakash V. (2007), “Purification and characterization of a new endoglucanase from Aspergillus aculeatus”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55(18), pp.7566-7572.
45. Nsereko V. L., Beauchemin K. A., Morgavi D. P., Rode L. M., Furtado A. F., McAllister T. A., Iwaasa A. D., Yang W. Z., and Wang Y. (2002), “Effect of a fibrolytic enzyme preparation from Trichoderma longibrachiatum on the rumen microbial population of dairy cows”, Canadian Journal of Microbiology, 48, pp. 14–20.
46. Pascual J. J. (2001), “Recent advances on early weaning and nutrition around weaning ,” in Proceedings of the 2nd Meeting of COST 848 Working Group 4, pp. 31-36.
47. Paul L. H., Nielsen J., Patrick A. S. and Maxwell G. S. (1977), “Purification and Properties of a Cellulase from Aspergillus niger”, Biochemical Journal, 165, pp.33-41.
48. Pazarlioglu N. K., Sariisik M., and Telefoncu A. (2005), “ Treating denim fabrics with immobilized commercial cellulases”, Process Biochemistry, vol. 40, no. 2, pp. 767-771.
49. Pilz I., Schwarz E., Kilburn D. G., Miller R. C., Warren R. A. J., Gilkes N. R. (1990), Biochemical Journal, 271, pp. 277.
50. Sakon J., Irwin D., Wilson D. B., Karplus P. A. (1997), Nature Structural & Molecular Biology, 4, pp. 810.
51. Schimz K. L., Broll B., John B. (1983), “Cellobiose phosphorylase (EC2.4.1.20) of Cellulomonas: occurrence. Induction. And its role in cellobiose metabolism”, Archives of Microbiology, 135, pp. 241-249.
52. Schloesser A., Alderkamp T., Schrempf H. (2000), “ Binding characteristics of CebR. The regulator of the ceb operon required for cellobiose/cellotriose uptake in Streptomyces reticuli”, FFMS Microbiology Letters, 190, pp. 127- 132.
53. Schwarz W. H. (2001), “ The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria”, Applied Microbiology and Biotechnology, 56, pp. 634- 649.
54. Schwarz W. H., Gra¨bnitzF, Staudenbauer W. L. (1986), “Properties of
Clostridium thermocellum endoglucanase produced in Escherichia coli”,
Applied and Environmental Microbiology, 51, pp. 1293-1299.
55. Seiboth B., Hakola S., March R. L., Suomien P., Kubicek C. P. (1997), “Role of four major cellulases in triggering cellulase gene expression in
Trichoderma reesei”, Journal of Bacteriology, 179, pp. 285-289.
56. Shrivastava B., Thakur S., Khasa Y. P., Gupte A., Puniya A. K., and Kuhad R. C. (2011), “White-rot fungal conversion of wheat straw to energy rich cattle feed,” Biodegradation , vol. 22, no.4, pp. 823–831.
57. Sieo C.C., Abdullah N., Tan W.S., Ho Y.W. (2005), “ Influence of β- glucanase-producing Lactobacillus strains on intestinal characteristics and feed passage rate of broiler chickens”, Poutry Science, 84, pp. 734-741. 58. Singh A., Kuhad R. C., and Ward O. P. (2007), “Industrial application of
microbial cellulases,” in Lignocellulose Biotechnology: Future Prospects, Kuhad R. C. and Singh A., Eds., pp. 345–358, I. K .International Publishing House, New Delhi, India.
59. Slominski B. A., Meng X..,Campbell L. D., Guenter W., Jones O. (2006), “The use of enzyme technology for improved energy utilization from full-fat oilseeds”, Poultry Science, 85 (6), pp. 1031-1037.
60. Teng D., Fan Y., Tian ZG., Luo J., Wang J.H. (2007), “Codon optimization of Bacillus licheniformis beta-1,3-1,4-glucanase gene and its expression in
Pichia pastoris”, Applied Microbiology and Biotechnology, 74(5), pp. 1074- 1083.
61. Tomme P., Warren R. A. J., Gilkes N. R. (1995), “Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi. In: Poole RK (ed) Advances in microbial physiology”,
Academic Press, London , Tomme P., Warren A. J., Miller R. C., Kilburn D. G., Gilkes N. R. (1995), “Cellulose-binding domains: classification and properties”, In: Saddler J. N., Penner M. H. (eds) “Enzymatic degradation of insoluble carbohydrates”, American Chemical Society, Washington, DC, 142.
62. Valeria V. M., Alexander V. G., Ruslan M. A., Artyom G. P., Dmitry O. O. and Arkady P. S. (2010), “Cellulases of Penicillium verruculosum”,
Biotechnology Journal, 5, pp. 871–880.
63. Warren R. A. J (1997), “ Structure and function in β-1,4- glycanase”, In: Claeyssens M., Nerinckx W., (eds), “ Carbohydrases from Trichoderma reesei and other microorganisms”, Structures, biochemistry, genetics and applications, Ghent Belgium Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, 115.
64. Xu G.Y., Ong E., Gilkes N. R., Kilburn D. G., Muhandriam D. R., Harris- Brandts M., Carver J. P., Kay L. E., Harvey T. S. (1995), Biochemistry, 34, pp. 6993.
65. Yi W. H., Gerhard K., Sylvain C., Hugues D. and Georg L. (2005), “A highly acid-stable and thermostable endo-β -glucanase from the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus solfataricus”, Biochemistry Journal, 385, pp. 581–588.
Tài liệu từ website
66. http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/CBM.html.
67. CAZy. for carbohydrate-active enzyme database; http://www.cazy.org 68. http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm.