Chủng nấm mốc lựa chọnđược nuôi trên cơ chất hỗn hợp gồm bã malt, bã mía, cám gạo với tỉ lệ 1: 1:1. Cụ thể lượng cơ chất đem nuôi trên 1 bình 1 lít là 15g cám gạo, 15 g bã malt, 15 g bã mía đã loại lignin bằng dung dịch NaOH 3%. Môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm dung dịch Maldel với thể tích: 100ml/ bình nhằm cung cấp đủ khoáng cũng như đảm bảo độ ẩm thích hợp để chủng phát triển tốt. Môi trường nuôi chiết sau khi được cân đủ các thành phần như trên được hấp thanh trùng ở 121°C/ 15 phút.
Chủng nấm mốc được hoạt hóa trên đĩa thạch PDA trước khi được cấy với số lượng lớn trên môi trường thạch nghiêng PDA để chuẩn bị vào giống. Giống phát triển tốt trên thạch nghiêng sau 5 ngày nuôi cấy, dùng Tween 0,05% đã thanh trùng cào toàn bộ bào tử trên ống giống rồi chuyển sang bình Schott vô trùng. Tính toán lượng Tween bổ sung vào mỗi ống thích hợp để có thể tích bào tử đủ lớn chuẩn bị vào giống. Sau khi vào giống, đem bình đi nuôi ở 30°C trong 7 ngày liên tiếp, mỗi ngày đảo cơ chất một lần.
Sau 7 ngày nuôi cấy, tiến hành chiết enzyme. Với mỗi bình bổ sung 450ml đệm Natri-acetate 0,05 M pH 5 đem lắc trong 2 giờ ở 30°C, 150 vòng/ phút để enzyme được chiết vào trong đệm. Ly tâm dịch vận tốc 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4°C, thu dịch trong.
2.4.16.Cô đặc dịch chiết enzyme bằng hệ thống lọc crossflow màng 10 kDa
Vì dịch enzyme tính toán thu được là 10 lít nên chúng tôi tiến hành cô đặc dịch enzyme xuống 1 lít để tăng nồng độ enzyme cũng như để tiện trong quá trình bảo quản.
Nguyên tắc của phương pháp: Khi cho dung dịch chảy luân hồi qua cột crossflow màng 10 kDa thì những phân tử có kích thước lớn hơn 10 kDa sẽ được
giữ lại trong cột. Phần lớn các phần tử giữ lại trong cột là các protein trong đó có protein enzyme mà ta quan tâm, các phần tử có kích thước nhỏ hơn 10 kDa như các phân tử muối, đường, chất màu, cặn nhỏ sẽ chui qua lỗ màng đi ra cùng với dịch thải. Quá trình cô đặc là luân hồi cho đến khi đạt thể tích mà ta mong muốn thì dừng lại.
Quá trình thực hiện như sau:
Trước khi cô đặc, rửa màng bằng lần lượt các các dung dịch sau: 2 lần nước cất mỗi lần 500 ml để rửa sạch ethanol 20% ra khỏi cột 500 ml SDS 0,1% để rửa sạch cột
500 ml NaOH 0,5 M để rửa cột
Rửa bằng nước cất đến khi nước chảy ra trong cột là trung tính
Cân bằng cột bằng đệm Natri-acetate 0,05M pH 5,0 bằng 1000 ml chia làm 2 lần. Cho dịch enzyme vào cô đặc cho đến khi đạt thể tích mong muốn
Kết thúc cô đặc tiến hành rửa cột bằng các dung dịch như trên. Cuối cùng bảo quản cột trong ethanol 20% cho lần sử dụng tiếp sau.