Phõn loại vi khuẩn

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.2.6. Phõn loại vi khuẩn

2.2.6.1. Đặc điểm hỡnh thỏi

- Hỡnh dạng khuẩn lạc của vi khuẩn được quan sỏt trờn mụi trường Posgate C sau 3-5 ngày nuụi cấy.

- Hỡnh thỏi tế bào vi khuẩn được quan sỏt trờn tiờu bản sống và tiờu bản cố định dưới kớnh hiển vi quang học Olympus - Nhật, chụp ảnh qua kớnh hiển vi điện tử quột JSM-5410LV- Nhật tại Viện 69- Bộ Tư lệnh Lăng Bỏc theo trỡnh tự như sau: vi khuẩn sau khi nuụi cấy được 5-7 ngày, đem ly tõm ở 7000vũng/phỳt trong 20 phỳt, loại bỏ dịch trong, thu cặn, rồi rửa tế bào bằng đệm cacodylat (pH 7,2-7,4). Sau đú cố định tế bào bằng glutaraldehyd 2,5% trong 2 giờ. Rửa cỏc mẫu thu được bằng đệm cacodylat, cố định bằng axớt osmic 1% trong 1 giờ rồi lại rửa bằng đệm cacodylat, sau đú khử nước bằng cồn (30, 50, 70, 90, 100%). Cho mẫu lờn đế cú băng dớnh cacbon. Phủ vàng lờn bề mặt mẫu bằng mỏy JFC-1200 - Nhật. Chụp ảnh trờn kớnh hiển vi điện tử quột.

2.2.6.2. Cỏc phương phỏp sinh học phõn tử a, Tỏch chiết ADN

Nguyờn tắc: Thành tế bào của vi sinh vật được phỏ vỡ bởi lyzozym. Sử dụng Tris-HCl làm chất đệm. Protein và ARN được tỏch ra khỏi ADN nhờ cỏc enzym RNazaA, proteaza K và cỏc dung mụi chloroform : isoamyl alcohol (24:1).

Cuối cựng ADN được tủa bằng etanol tuyệt đối và xỏc định nồng độ ADN trong dịch mẫu.

Tiến hành: ADN được chiết xuất và tỏch từ sinh khối ướt theo phương phỏp của Saito và Miura. Lấy 3 vũng que cấy sinh khối tế bào sau 14 giờ nuụi, ly tõm lạnh ở 4oC với tốc độ 8000 vũng trong 15 phỳt và rửa 2 lần bằng 300L dung dịch muối EDTA pH 8,0 (0,5M Na2EDTA, 0,15M NaCl). Sau đú tạo dịch huyền phự trở lại trong 200L đệm 10TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0, tỷ lệ mẫu: đệm, 1: 2). Bổ sung 10L của lyzozym (Sigma, 1mg/mL Lysozym), giữ ở 37oC trong nồi cỏch thuỷ trong 15 phỳt. Bổ sung dung dịch Tris-SDS (0,1M Tris-HCl pH 9,0 và 1% SDS) với thể tớch bằng thể tớch mẫu.

Dịch mẫu được giữ ở 60oC trong nồi cỏch thuỷ 10-30 phỳt. Sự tan tế bào được xỏc định bằng sự trong suốt của dung dịch cựng với sự tăng độ nhớt tương ứng. Dịch tan tế bào được làm lạnh trong đỏ trong 10 phỳt, bổ sung 150L cloroform-isoamyl alcohol, 24:1, v/v (giữ ở 4oC) với thể tớch bằng 1/3 thể tớch mẫu. Ly tõm lạnh ở 4oC với tốc độ 10.000 vũng trong 20 phỳt để phõn lớp.

Sau đú chuyển phần nhớt ở phần đầu sang Eppendorf (Cỡ 1,5mL) mới và ADN được tỏch ra bằng bổ sung etanol lạnh (etanol 95,5% giữ ở -22oC) với thể tớch gấp đụi thể tớch mẫu và 2L của 3M Na acetat (pH=4,5).

Ngõm ADN trong 100L etanol 70% trong 30 phỳt và sau đú ngõm liờn tiếp trong etanol 80, 90, 95% cho mỗi nồng độ trong 5 phỳt. Sợi ADN làm khụ bằng nhiệt độ phũng trong 10 phỳt và được làm tan trở lại trong 20L đệm 0,1TE (10TE) ở 4oC qua đờm.

tỏ sự cú mặt của protein. Bước súng 230nm biểu hiện sự cú mặt của chất đệm, cỏc muối như EDTA và của ARN. Cỏc tỷ lệ chuẩn về hấp thụ của ADN ở cỏc bước súng 230 : 260 : 280 là 1,0 : 0,45 : 0,515. Hàm lượng ADN được tớnh như sau: 1 đơn vị OD (mật độ quang, Optical Density) ở 260nm tương đương với 50g/mL ADN.

Cỏch tớnh: Đơn vị mẫu  độ loóng  chỉ số/1000 = ADN g/L.

Nếu ADN chưa sạch cần khử protein và ARN bằng enzym proteaza K và RNazaA

b, Phản ứng PCR

Nguyờn tắc: Phương phỏp này sử dụng ADN polymeraza và cỏc

oligonucleotit tổng hợp nhõn tạo, một đoạn ADN dựng làm khuụn để nhõn lờn nhanh chúng với số bản sao gấp hàng tỷ lần mà khụng cần đến nhiều tế bào vi khuẩn. Nhờ phản ứng này một đọan gen bất kỳ sẽ được khuếch đại khi biết được trỡnh tự nucleotit ở hai đầu, ta đó tổng hợp được cặp mồi bổ sung với trỡnh tự của hai điểm từ đầu 5’ tới đầu 3’ của sợi bổ sung và nhờ cú enzym ADN polymeraza mà ADN khuụn được tổng hợp khi đó cú sẵn dNTP.

Tiến hành: Mỗi chu kỳ của phản ứng đũi hỏi 3 bước:

Biến tớnh (denaturation) sợi ADN bằng nhiệt độ, ADN được tỏch thành hai sợi đơn. Nhiệt độ giảm xuống cho phộp mồi bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khuụn. Hỗn hợp ADN và mồi được ủ với enzym Taq polymeraza và dNTP giỳp cho việc tổng hợp ADN mới bổ sung với sợi ADN gốc.

Khi cỏc chu kỳ được lặp lại, cỏc đoạn ADN vừa mới được tổng hợp ở cỏc chu kỳ trước trở thành khuụn cho chu kỳ sau. Số chu kỳ lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thường khụng quỏ 30 chu kỳ và mỗi phản ứng PCR thường kộo dài khoảng 2-3 giờ. Khi thực hiện phản ứng PCR, một số yếu tố ảnh

hưởng đỏng kể đến kết quả của phản ứng như nồng độ mồi, nhiệt độ và thời gian ủ mồi, nồng độ ADN khuụn, nồng độ một số ion, như Mg2+.

* Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR

Trỡnh tự mồi: Mồi xuụi 27 5’-agagtttgatcctggctcag-3’ 8-27 Mồi ngược 1525 5’-aaaggaggtgatccagcc-3’ 1543-1525

dNTP (2,5mM) 2L

Mồi 0,5L (10pmol cho mỗi loại mồi (ngược và xuụi) 10 Taq buffer 0,25L

Mẫu (50-90ng) 2L

Taq polymeraza 0,3L (Taq 5U/mL) Nước cất 12L

Tổng cộng thể tớch phản ứng 20 L

* Chương trỡnh chạy PCR

Biến tớnh DNA ở 94oC trong 1 phỳt.

Chạy nhắc lại 30 chu kỳ tại: 94oC  1phỳt. 50oC  1 phỳt. 72oC  90 giõy. Hết một chu kỳ.

Tổng hợp: 72oC  2 phỳt.

Kết thỳc chương trỡnh  4oC nhiệt độ bảo quản. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trờn gel aga

Pha đệm: Chỳng tụi tiến hành pha dung dịch đệm 10  TAE Tris 242g Axit axetic 57,1mL

0.5MEDTA. Na2 pH=8.0 100mL pha với một lớt Trong quỏ trỡnh chạy điện di dựng dung dịch đệm 1  TAE (của 10 

TAE pha loóng dịch 10 trong 100 mL nước cất đó khử trựng).

- Cõn 0,8- 1,2 g aga cho vào 100ml dung dịch đệm 1  TAE, đun sụi cho đến khi aga tan hết.

- Lắc đều để nguội đến 40-50oC. - Đổ gel vào khay đó cài sẵn lược.

- Để 30 phỳt cho tới khi bản gel cứng, rỳt lược và đặt khay gel vào mỏy điện di.

* Tra mẫu

- Dựng pipet hỳt 2Ldung dịch ADN trộn với 2L 6  đệm tải (loading buffer).

- Tra 1L của 1 kb ADN ladder (Takara) trộn với 2L của 6  loading buffer dựng như ADN chuẩn.

- Tra mẫu vào từng giếng.

* Chạy điện di với dũng điện 100V trong thời gian 20-30 phỳt cho tới khi vạch màu đến 2/3 bản gel.

* Soi bản gel trờn mỏy soi UV của Bio-rad.

Kết quả ADN mới được nhõn lờn trong phản ứng PCR sẽ hiện hỡnh dưới những vạch đỏ màu da cam.

c, Phõn tớch trỡnh tự rADN 16S

Nguyờn tắc: Việc phõn tớch trỡnh tự ADN cho phộp thực hiện một nghiờn cứu tỉ mỉ về ADN, nú cung cấp thụng tin cơ bản nhất đú là trật tự cỏc nucleotit, giỳp ta cú thể tỡm ra chức năng và trật tự gen, thực hiện những so sỏnh về cỏc gen tương ứng giữa những loài khỏc nhau và phõn loại cỏc dạng đột biến. Dựa trờn cỏc đoạn mồi đặc hiệu để phõn tớch trỡnh tự ADN của mẫu, cần xỏc định trực tiếp từ sản phẩm PCR.

Tiến hành: Tinh sạch sản phẩm PCR: Dựng Spinfilter unit (bộ kớt làm siờu sạch sản phẩm PCR), lấy 20L sản phẩm PCR cho vào Eppendorf, lọc qua spinfilter unit cú bổ sung 50L chất đệm spinbind sau đú loại bỏ dung dịch bằng siờu ly tõm tốc độ 13000 vũng/phỳt trong 30 giõy.

Spinfilter unit được rửa bằng 20L chất đệm spinclean, đem ly tõm 2 lần với tốc độ 13.000 vũng/phỳt trong 30 giõy. Sau đú spinfilter unit được cài vào một Eppendorf mới. Cuối cựng, tỏch sản phẩm ADN ra khỏi spinfilter unit bằng siờu ly tõm tốc độ 13000 vũng/phỳt trong 60 giõy cựng với 10L chất đệm rửa trụi.

- Xỏc định nồng độ ADN: Sản phẩm ADN sau được đo bằng cappilary cell bước súng 260nm và tớnh theo cụng thức: ADNABS 260  20  50ng/L.

- Sử dụng kit BigDye Terminator để phõn tớch trỡnh tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR: lấy chừng 1L sản phẩm sạch PCR (từ 30 hoặc 90ng) làm ADN khuụn và 3,2pmol/L primer cho vào ống PCR tube (0,2mL, MicroAmp PCR), 2L BigDye. Tổng thể tớch 20L. Cỏc mẫu được làm biến tớnh ở 96oC trong 3 giõy rồi thực hiện 25 chu kỳ theo chu trỡnh sau: 96oC trong 3 giõy, 50oC trong 5 giõy, 60oC trong 4 phỳt. Bước cuối cựng ở 4oC, thời gian bảo quản.

- Tủa sản phẩm ADN đó nhuộm và gắn với Big Dye: Bổ sung 2L của 3M Na acetat (pH=4,5) và 500L của etanol.

Ly tõm tốc độ 15000 vũng/phỳt trong 30 phỳt. Sau đấy mẫu được rửa hai lần trong 500L của 70% etanol, loại bỏ etanol dựng ly tõm 15000 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Làm khụ mẫu bằng thiết bị khụ chõn khụng trong 5 phỳt.

Làm lạnh ngay trong nước đỏ khoảng 5 phỳt. 10L mẫu tra vào giếng của khay mẫu và được phõn tớch trong thiết bị đọc trỡnh tự tự động ABI Prism 3100 Avant.

- Tỡm và so sỏnh trỡnh tự tương đồng

Vào trang Web: http://www.ddbj.nig.ac.jp vào DNA Data Bank of Japan  Database Search  Blast  Homology Search sau đú nhập dữ liệu của mỡnh vào  bấm vào Send. Trỡnh tự gửi vào sẽ được xỏc định tờn của loài nào giống với loài nào và tớnh tương đồng là bao nhiờu % trong 5 phỳt. Sau đú đưa vào file.

- Sắp xếp trật tự của cỏc nucleotit

Tiến hành sắp xếp trật tự của cỏc nucleotit cần so sỏnh bằng cỏch dựng chương trỡnh ClustalX 18.1 bấm vào Files sau đú Load sequence tiếp đến vào

Do complate Alignment chờ 30phỳt cho chương trỡnh của mỏy tự động sắp xếp cỏc trật tự nucleotit cần so sỏnh. Sau khi kết thỳc, sử dụng chương trỡnh

NilotWin95 để quan sỏt và phõn tớch cõy hệ thống tiến hoỏ của cỏc chủng đó

phõn tớch.