CHƯƠN G2 THỰC NGHIỆM
2.3 Thăm dũ hoạt tớnh sinh học của dẫn xuất pyrazol húa curcuminoid và phức chất của chỳng với Cu(I) và Cu(II):
phức chất của chỳng với Cu(I) và Cu(II):
Cỏc thớ nghiệm thử hoạt tớnh sinh học của cỏc mẫu nghiờn cứu đều được thực hiện bởi Phũng Sinh học thực nghiệm – Viện Húa học cỏc hợp chất thiờn nhiờn, VAST.
Phương phỏp thực nghiệm: theo phương phỏp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS(1993) hiện đang được ỏp dụng tại Viện nghiờn cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
Thử khả năng gõy độc tế bào
Tế bào ung thư được duy trỡ ở cỏc điều kiện tiờu chuẩn và được test với cỏc mẫu thử đó được chuẩn bị sẵn ở cỏc nồng độ khỏc nhau trờn phiến vi lượng 96 giếng. Phiến thử nghiệm gồm: tế bào nuụi cấy + mụi trường nuụi cấy + chất thử, được ủ ở nhiệt độ 370C trong 3 ngày để tế bào phỏt triển. Sau đú tế bào được lấy ra cố định, rửa, nhuộm và hoà lại bằng dung dịch chuẩn, đọc kết quả trờn mỏy Elisa ở bước súng 515 - 540 nm.
Giỏ trị IC50 được tớnh trờn chương trỡnh Table curve với giỏ trị logarit dựa trờn dóy cỏc thang nồng độ khỏc nhau của chất thử và giỏ trị OD đo được.
Cỏc mẫu chiết thụ cú giỏ trị IC50 ≤ 20 àg/ml được xem là cú hoạt tớnh. Cỏc mẫu chiết tinh cú giỏ trị IC50 ≤ 5 àg/ml được xem là cú hoạt tớnh.
Dũng tế bào thăm dũ:
Dũng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma – Ung thư gan) Lu (Lung cancer – Ung thư phổi)
RD (Rhabdo sarcoma – Ung thư màng tim)
Mụi trường nuụi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt), cú bổ sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF(Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum). Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro Axetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Axetic.
Cỏc dụng cụ dựng 1 lần: Bỡnh nuụi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, cỏc đầu tip cho micropipet…
Chất chuẩn chứng dương tớnh:
Dựng chất chuẩn cú khả năng diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO.
- Đọc trờn mỏy ELISA ở bước súng 495-515nm
Tớnh kết quả:
Giỏ trị CS: là khả năng sống sút của tế bào ở nồng độ nào đú của chất thử tớnh theo % so với đối chứng. Dựa trờn kết quả đo được của chỳng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sỏnh với giỏ trị OD khi trộn mẫu để tỡm giỏ trị CS(%) theo cụng thức:
OD (mẫu) – OD (ngày 0)
CS% = x 100 OD (DMSO) – OD (ngày 0)
Giỏ trị CS% sau khi tớnh theo cụng thức trờn, đựơc đưa vào tớnh toỏn Excel để tỡm ra % trung bỡnh ± độ lệch tiờu chuẩn của phộp thử được lặp lại 3 lần theo cụng thức của Ducan như sau: Độ lệch tiờu chuẩn σ
Σ (xi - x )2
σ =
n - 1
Cỏc mẫu cú biểu hiện hoạt tớnh (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tỡm giỏ trị IC50
Giỏ trị IC50 : dựng giỏ trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trỡnh Table curve theo thang gớa trị logarit của đường cong phỏt triển tế bào và nồng độ chất thử để tớnh giỏ trị IC50. Cụng thức: 1/y=a+blnX
Trong đú Y: nồng độ chất thử; X: Giỏ trị CS (%) Đồ thị tớnh giỏ trị IC50 của mẫu:
CHƯƠNG 3