3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu
Gồm 49 giống lúa nếp ựịa phương thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Danh mục các giống tham gia thắ nghiệm
STT Ký hiệu Tên Giống STT Ký hiệu Tên Giống
1 10055 Lúa nếp (3) 26 10171 Nếp 5 2 10057 Lúa nếp 27 10173 Lúa nếp nương 3 10068 Bao thai nương 28 10176 - 4 10072 Lúa nếp ựịa phương 29 10179 - 5 10090 Lúa nương 30 10273 Lọ trâu 6 10094 Cẩm lùn 31 10279 Lúa sumang châu) ồng (khẩu 7 10095 Nếp Belanh 32 10282 Nếp ựen (cà cuống) 8 10098 Nếp cẩm vỏựỏ 33 10285 Khẩu sau ou 9 10100 Nếp kho mu 34 10292 Ngo gia 10 10103 Nếp 352 35 10590 Lúa ựịa phương 11 10105 Nếp cẩm vỏ trắng 36 10618 Lúa ựịa phương 12 10107 Cam tu cây thấp 37 10640 Nếp tan
13 10108 - 38 10641 -
14 10113 Nếp nương ựịa phương 39 10646 Lúa nếp 15 10124 Cam vo ựo 40 10654 Nếp phước chia
16 10128 Lúa nương 41 10668 - 17 10137 - 42 10675 - 18 10144 Nếp tròn 43 10678 Kho hot 19 10153 Nếp cẩm do vỏ trắng 44 10681 Nếp ruộng 20 10156 Lúa ựịa phương 45 10695 - 21 10163 Nếp nương 46 10698 -
22 10165 Nếp nương 47 10699 Lúa nương 23 10167 Nếp 48 10158 - 1 Nếp trau hạt trong
24 10168 Nếp 2 49 10280-2 -
25 10169 -
Chú thắch: - Không rõ tên giống
* đối chứng
+ đối chứng TK90 (là giống lúa nếp ựược trồng phổ biến hiện nay) dùng ựểựánh giá ựặc ựiểm nông sinh học.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ36
nhiễm nhân tạo.
+ Ba giống IRBB4, IRBB5, IRBB7 mang gen kháng chuẩn Xa4, xa5, Xa7 dùng ựể phát hiện gen kháng bệnh bạc lá trong quá trình chạy PCR.
* Hóa chất
- Dùng trong tách chiết ADN: NaCl 5M, EDTA 0,5 M, Tris HCl 1M, nước cất, ethanol, TE, Chloroform.
- Dùng trong nhân gen: Primer F, Primer R, nước cất vô trùng không chứa nucleotit dùng cho PCR.
- Dùng trong ựiện di và quan sát sản phẩm ựiện di: agarose, TAE1X, loading bufer, ethilium bromide, marker.
- Dùng trong ựánh giá chất lương gạo: KOH 1.7%, Ethanol 95 %, NaOH 1N, dung dịch Iod (0.2 % I2 + 2% KI ).
*Dụng cụ:
Pipep, ống nghiệm 1500ộl, 200 ộl.
Máy li tâm, máy ựiện di, máy PCR, máy Photodyne, lò vi sóng, khoấy từ, Ầ và nhiều dụng cụ khác trong phòng thắ nghiệm.
3.2 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 1/2009 ựến tháng 6/2009
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp khảo sát tập ựoàn các giống lúa nếp ựịa phương
* Thắ nghiệm ựược thực hiện tại khu thắ nghiệm trường đại học Nông nghiệp Hà Nội
* Bố trắ thắ nghiệm: Thắ nghiệm ựược bố trắ tuần tự không nhắc lại, mỗi giống thắ nghiệm cấy 2 hàng dài 5 m.
- Kỹ thuật cấy: Cấy 1 dảnh, mật ựộ: 45 khóm/m2, khoảng cách:cây - cây 11cm, hàng - hàng 20cm, khoảng cách giữa 2 giống là 25cm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ37
* Phân bón: Lượng bón cho 1 ha là: 120kg N + 90 kg P2O5 + 60kg K2O . - Cách bón:
+ Bón lót: 100% P2O5 + 30% N
+ Bón thúc lần 1: 40% N + 50% K2O khi lúa bén rễ hồi xanh kết hợp làm cỏ sục bùn.
+ Bón thúc lần 2: 30% N + 50% K2O khi lúa ựứng cái, làm ựòng.
* Các chỉ tiêu theo dõi
Các chỉ tiêu theo dõi dựa theo tiêu chuẩn 10TCN 558 - 2002 , Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn [15] và tiêu chuẩn ựánh giá cây lúa của IRRI [42].
* Giai ựoạn mạ trước khi cấy
Trước khi cấy lấy 10 cây mạ ngẫu nhiên của mỗi dòng giống ựểựo ựếm các chỉ tiêu sau: tuổi mạ; số lá mạ; chiều cao cây mạ; màu sắc lá mạ.
+ Sức sinh trưởng (cho ựiểm 1,5,9 theo tiêu chuẩn 10 TCN 558 -2002):
điểm 1 - Mạnh: cây sinh trưởng tốt, lá xanh, nhiều cây có hơn 1 dảnh.
điểm 5 - Trung bình: cây sinh trưởng trung bình, hầu hết có 1 dảnh.
điểm 9 - Yếu: cây mảnh, yếu, còi cọc, lá vàng.
* Giai ựoạn từ cấy ựến thu hoạch
Mỗi ô thắ nghiệm theo dõi 10 khóm cốựịnh, tuỳ từng chỉ tiêu. + Theo dõi thời gian từ cấy ựến:
- Bén rễ hồi xanh: khi có 85% số cây bến rễ hồi xanh (quan sát cả quần thể). - Bắt ựầu ựẻ nhánh: 10% số cây có nhánh ựẻ dài 1 cm nhô khỏi bẹ lá. - Kết thúc ựẻ nhánh: khi những khóm theo dõi có số nhánh không ựổi. - Ngày bắt ựầu trỗ: 10% số cây có tối thiểu 1 bông trổ lên khỏi bẹ lá ựòng (quan sát cả quần thể).
- Ngày kết thúc trỗ: 85% số bông của các khóm trỗ ra khỏi bẹ lá ựòng 5cm (quan sát cả quần thể).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ38 đánh giá thời gian sinh trưởng của cây lúa vụ xuân ở phắa Bắc theo tiêu chuẩn 10 TCN 558 -2002 ựược chia thành 4 nhóm.
Nhóm cực ngắn ngày: < 115 ngày Nhóm ngắn ngày: 115 Ờ 135 ngày Nhóm trung bình: 136 Ờ 160 ngày Nhóm dài ngày: > 160 ngày
+ Theo dõi các ựặc ựiểm hình thái
- Màu sắc phiến lá khi ựẻ nhánh rộ (ựánh giá theo tiêu chuẩn IRRI): 1 - xanh nhạt, 2 - xanh, 3 - xanh ựậm, 4 - tắm ở ựỉnh lá, 5 - tắm ở mép lá, 6 - có
ựốm tắm (xen lẫn với màu xanh), 7 -tắm. - Kiểu ựẻ nhánh: chụm, xoè, hơi xoè
- Một số chỉ tiêu về lá ựòng (ựánh giá theo tiêu chuẩn 10 TCN 558 -2002): # Dài lá ựòng: Phân nhóm lá ựòng theo chiều dài:
Nhóm lá ựòng dài: > 35cm. Nhóm lá ựòng trung bình: từ 25 ựến 35cm. Nhóm lá ựòng ngắn: < 25cm. # Rộng lá ựòng cũng chia làm 3 nhóm lá ựòng: Nhóm lá ựòng rộng: > 1,7cm. Nhóm lá ựòng trung bình: từ 0,8 ựến 1,7cm. Nhóm lá ựòng ngắn: < 0,8cm.
# độ dày lá ựòng: ựánh giá cảm quan bằng phương pháp sờ và cảm nhận. # Góc lá ựòng (so với trục của bông): ựứng, trung bình, ngang, gập xuống. - độ phủ lông của lá: quan sát bằng mắt kết hợp sờ cảm nhận và ựánh giá theo tiêu chuẩn 10 TCN 558 -2002: 1- trơn, 2 Ờ trung bình, 3 - phủ lông.
- Chiều dài cổ bông: ựo từ gối lá ựòng ựến ựốt cổ bông, ựánh giá theo tiêu chuẩn IRRI: 1: Thoát tốt 7: Thoát một phần
3: Thoát trung bình 9: Không thoát ựược
5: Vừa ựúng cổ bông
+ Các chỉ tiêu nông sinh học: tổng số nhánh trên khóm, nhánh hữu hiệu trên khóm, tỷ lệ nhánh hữu hiệu trên khóm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ39 đánh giá khả năng ựẻ nhánh theo tiêu chuẩn IRRI
Khă năng ựẻ nhánh rất cao: có số nhánh tối ựa > 25 nhánh/khóm. Khả năng ựẻ nhánh tốt: có số nhánh tối ựa từ 20 Ờ 25 nhánh/khóm. Khả năng ựẻ nhánh trung bình: có số nhánh tối ựa từ 10 Ờ 19 nhánh/khóm. Khả năng ựẻ nhánh thấp: có số nhánh tối ựa từ 5 Ờ 9 nhánh/ khóm. Khả năng ựẻ nhánh rất thấp có số nhánh tối ựa < 5 nhánh/khóm.
* Theo dõi tình hình sâu bệnh trên ựồng ruộng
+ Theo dõi, ựánh giá và cho ựiểm theo tiêu chuẩn 10 TCN - 558 một số
loại sâu bệnh chắnh thường gặp trên ựồng ruộng ở vụ xuân như: sâu cuốn lá, sâu ựục thân, bệnh ựạo ôn, bệnh khô vằn và bệnh bạc lá.
- Sâu ựục thân (Tryporyza incertulas): Tắnh tỷ lệ dảnh chết hoặc bông bạc do sâu hại
điểm 0: Không bị hại điểm 5: 21 Ờ 30%
điểm 1: 1 Ờ 10% số dảnh chết hoặc bông bạc điểm 7: 31 Ờ 50%
điểm 3: 11 Ờ 20% điểm 9 > 50%
- Sâu cuốn lá (Cnaphalocrosis): Tắnh tỷ lệ cây bị sâu ăn phần xanh của lá hoặc lá bị cuốn thành ống.
điểm 0: Không bị hại đểm 5: 21 Ờ 35%
điểm 1: 1 Ờ 10% cây bị hại điểm 7: 36 Ờ 51%
điểm 3: 11 Ờ 20% điểm 9: > 51%
- Bệnh ựạo ôn lá (Pyricularia oryzae):
điểm 0: không có vết bệnh
điểm 1: Vết bệnh màu nâu hình kim châm ở giữa, chưa xuất hiện vùng sinh sản bào tử.
điểm 2: Vết bệnh nhỏ, tròn hoặc hơi dài, ựường kắnh 1 Ờ 2mm, có viền nâu rõ rệt, hầu hết lá dưới có vết bệnh.
điểm 3: Dạng vết bệnh như ở ựiểm 2, nhưng vết bệnh xuất hiện nhiều ở
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ40 điểm 4: Vết bệnh ựiển hình cho các giống nhiễm, dài 3mm hoặc hơi dài, diện tắch vết bệnh trên lá < 4% diện tắch lá. điểm 5: Vết bệnh ựiển hình 4 Ờ 10% diện tắch lá. điểm 6: Vết bệnh ựiển hình 10 Ờ 25% diện tắch lá điểm 7: Vết bệnh ựiển hình 26 Ờ 50% diện tắch lá. điểm 8: Vết bệnh ựiển hình: 51 Ờ 75% diện tắch lá. điểm 9: Hơn 75% diện tắch vết bệnh trên lá .
- Bệnh ựạo ôn cổ bông (Pyricularia oryzae): Quan sát vết bệnh gây hại xung quanh cổ bông.
điểm 0: không có vết bệnh hoặc chỉ có vết bệnh trên vài cuống bông
điểm 1: Vết bệnh trên vài cuống bông hoặc trên gié cấp 2.
điểm 3: Vết bệnh có trên vài gié cấp 1 hoặc phần giữa của trục bông.
điểm 5: Vết bệnh bao quanh một phần gốc bông hoặc phần thân rạ hắa dưới trục bông.
điểm 7: Vết bệnh bao quanh toàn bộ cổ bông hoặc phần trục gần cổ
bông, có hơn 30% hạt chắc.
điểm 9: Vết bệnh bao quanh hoàn toàn cổ bông hoặc phần thân rạ cao nhất, hoặc phần trục gần gốc bông, số hạt chắc ắt hơn 30%.
- Bệnh bạc lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae): Quan sát diện tắch vết bệnh trên lá: điểm 1: 1 Ờ 5% diện tắch vết bệnh trên lá
điểm 3: 6 Ờ 12 % diện tắch vết bệnh trên lá
điểm 5: 13 Ờ 25% diện tắch vết bệnh trên lá
điểm 7: 25 Ờ 50 % diện tắch vết bệnh trên lá
điểm 9: 51 Ờ 100% diện tắch vết bệnh trên lá
- Bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani) Quan sát ựộ cao tương ựối của vết bệnh trên lá hoặc bẹ lá (biểu thị bằng % so với chiều cao cây).
điểm 0: Không có triệu chứng điểm 5: 31 Ờ 45%
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ41
điểm 3: 20 Ờ 30% điểm 9: > 65%
* Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất
Mỗi dòng lấy 10 khóm, nhổ cả gốc, rửa sạch, ựeo thẻ, phơi khô rồi ựo
ựếm các chỉ tiêu sau:
+ Chiều cao cây cuối cùng (cm) (ựo 5 cây): đo từ mặt ựất ựến ựỉnh bông cao nhất (không kể râu hạt). đánh giá theo tiêu chuẩn 10 TCN Ờ 558 chia chiều cao cây lúa thành 3 nhóm:
Nhóm thấp cây (nửa lùn): có chiều cao cây < 90 cm. Nhóm trung bình: có chiều cao cây từ 90 Ờ 125 cm. Nhóm cao cây: có chiều cao cây > 125 cm.
+ Chiều dài bông (ựo 5 bông)
điểm 1: Rất ngắn (< 20 cm) điểm 3: Ngắn (20 - 25cm)
điểm 5: Trung bình (26 -30 cm) điểm 7: Dài (31- 35 cm)
điểm 9: Rất dài (> 35cm)
+ Số bông hữu hiệu/khóm: đếm số bông có ắt nhất 10 hạt chắc của một cây (A).
+ Số hạt/bông (B).
+ Tỷ lệ hạt chắc/bông (C).
+ Khối lượng 1000 hạt (g): Cân 8 mẫu 100 hạt ởẩm ựộ 13% (D) và ựánh giá theo tiêu chuẩn IRRI.
Nhóm hạt to: khối lượng 1000 hạt > 26 g
Nhóm hạt trung bình: có khối lượng 1000 hạt từ 24 Ờ 26 g Nhóm hạt nhỏ: có khối lượng 1000 hạt < 24 g
+ Năng suất lý thuyết = A x B x C x D 10-4 x Số khóm/m2 (tạ/ha)
+ Năng suất cá thể(g/khóm): Cân khối lương hạt thu ựược trên 1 khóm
ở ẩm ựộ 14%.
* Các chỉ tiêu về chất lượng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ42
# Chiều dài hạt: Mỗi mẫu lấy ngẫu nhiên 10 hạt gạo lật, nguyên, tiến hành ựo chiều dài bằng thước Peacock (since 1916) và phân loại chiều dài theo tiêu chuẩn IRRI (1996):
+ Quá dài: >7,5 mm + Trung bình: 5,5-6,6 mm. + Dài: 6,6-7,5 mm + Ngắn: <5,5 mm.
# Hình dạng hạt: ựược tắnh theo tỷ lệ Dài/Rộng và phân loại theo tiêu chuẩn IRRI (1996).
+ D/R > 3,0: thon dài. + D/R từ 2,1 Ờ 3,0: trung bình. + D/R từ 1,1 Ờ 2,0: bầu. + D/R < 1,0: tròn.
- Chất lượng nấu nướng và ăn uống + Hàm lượng amylose
định lượng hàm lượng amylose theo phương pháp của H.Seko, 2003 Ờ phân nhóm hàm lượng amylose theo tiêu chuẩn của IRRI.
Chuẩn bị hoá chất: Ethanol 95 %, NaOH 1N, dung dịch Iod (0.2 % I2
+ 2% KI )
Cách làm: Lúa bóc vỏ, làm trắng, nghiền nhỏ, lấy 100 mg bột ựã nghiền thêm vào 1ml Ethanol, thêm tiếp 9ml NaOH, ựun sôi ở 100oC trong 10 phút rồi
ựịnh mức cho dủ 100ml. Lấy ra 5ml dung dịch hoà tan, cho thêm vào 1ml CH3COOH 1M, thêm 2ml dung dịch Iod, ựịnh mức cho ựủ 100ml, giữ ấm ở
30oC trong vòng 2 phút. đo OD ở bước sóng 620nm trên máy ựo quang phổ và
ựọc giá trị. đối chiếu với bảng quy ựổi tìm ra hàm lượng amylose. Phân nhóm hàm lượng amylose theo tiêu chuẩn của IRRI (1998). Hàm lượng amylose Nhóm amylose
0 Ờ 2 Nếp 3 Ờ 9 Rất thấp 10 Ờ 19 Thấp 20 Ờ 25 Trung bình > 25 Cao.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ43
+ Nhiệt ựộ trở hồ (theo phương pháp của Little và cs)
Lấy 6 hạt gạo ựã ựược xát trắng, không có vết nứt và sắp vào ựĩa petri. Cho vào mỗi ựĩa 10ml dung dịch KOH 1.7%, ựậy nắp và ựể trong 23giờ ở
30oC. Nhiệt ựộ hoá hồ ựược xác ựịnh bằng mức ựộ lan rộng và ựộ trong suốt của hạt gạo sau xử lý.
đánh giá nhiệt ựộ trở hồ và ựộ phân huỷ trong kiềm theo thang ựiểm của IRRI (1996):
điểm độ lan rộng độtrong ki phân huỷ
ềm Nhiệt ựộ hoá hồ
1 Hạt gạo còn nguyên Thấp Cao (>750C) 2 Hạt gạo phồng lên Thấp Cao (>750C) 3 Hạt gạo phồng lên, viên còn nguyên hay rõ nét Thấp Cao (>750C) 4 Hạt gạo phồng lên, viên còn nguyên và nở rộng Trung bình Trung bình (70-740C) 5 Hạt rã ra, viên hoàn toàn và nở rộng Trung bình Trung bình (70-740C) 6 Hạt rã ra, hoà chung với viên Cao Thấp (< 690C) 7 Hạt tan ra hoàn toàn và quyện vào nhau Cao Thấp (< 690C)
Mức trung bình của mẫu thửựược tắnh theo công thức: Nhiệt ựộ trở hồ = Tổng Xi . n / N
Trong ựó: Xi là cấp ựộ trở hồ. N là số hạt thử nghiệm.
n là số hạt có cấp ựộ trở hồ Xi
+ đánh giá mùi thơm: có thểựánh giá bằng mùi thơm trên lá và mùi thơm trên hạt gạo.
* Mùi thơm trên lá: Thu 10 lá của mỗi giống ở giai ựoạn ựẻ nhánh. Cắt 1g lá thành những mẩu dài 5mm và trộn với 5 ml dung dịch KOH 1,7%, ựậy nắp lại ngay và ựể ở nhiệt ựộ phòng trong vòng 10 phút. đánh giá mùi thơm bằng phương pháp ngửi và cho ựiểm theo tiêu chuẩn IRRI: