3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3 Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử PCR tìm gen kháng bệnh bạc lá
lá Xa4, xa5, Xa7
3.3.3.1 Quy trình chiết tách DNA (Theo phương pháp của Zheng và cộng sự
năm 1995) có cải tiến gồm 4 bước: phá vỡ tế bào, loại bỏ protein, kết tủa DNA, xác ñịnh mức ñộ tinh sạch và nồng ñộ DNA tổng số.
- Thành phần dung dịch chiết tách DNA Thành phần Nồng ñộ dung dịch mẹ Nồng ñộ dung dịch làm việc Hỗn hợp 10ml dung dịch chiết tách Tris-HCl (pH=8) 1M 50mM 0,5ml EDTA (pH=8) 0,5M 0,25mM 0,5ml NaCl 5M 300mM 0,6ml SDS 10% 1% 1,0ml H2O 7,4ml
* Pha các dung dịch mẹ dùng trong tách chiết DNA
Cách thức pha các dung dich mẹ dùng trong tách chiết DNA do GS.TS.S.Taura và cộng sự ñề xuất [56].
+ Chuẩn bị Tris HCl 1M, pH = 8: Cân 30,28 g Trizmabase MW: 212.1g (dung dịch rất kiềm) cho vào lọ. ðổ vào 200 ml nước cất. Chuẩn ñộ bằng HCl cho tới pH = 8. ðổ thêm nước vào cho tới khi hỗn hợp ñạt 250ml, hấp khử
trùng ở 121oc, 15 phút.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………47
tetraacetat (dung dịch hơi axit), cho vào lọ. ðổ vào 200ml H2O, cho tiếp vào 4g NaOH. Khuấy từ nhẹ nhàng, chỉnh pH bằng NaOH ñậm ñặc và ñổ nước cho tới khi thể tích ñạt 250ml.
+ Chuẩn bị NaCl 5M (MW. 54.44g): Cân 73,05g NaCl cho vào lọ. ðổ
vào 250ml H2O, khuấy ñều rồi ñem khử trùng.
+ SDS 10% (MW.288.4g): Cân 25g SDS cho vào lọ. Cho vào 200ml H2O, khuấy ñều từ từ bằng cách tăng thêm nhiệt (do khó tan). Cho thêm 50ml nước, ñể ở nhiệt ñộ phòng. - Thành phần dung dịch ñệm TE dùng ñể bảo quản DNA Thành phần Nồng ñộ dung dịch mẹ Nồng ñộ dung dịch làm việc Hỗn hợp 10ml dung dịch chiết tách Tris-HCl (pH=8) 1M 50mM 0,5ml EDTA (pH= 8) 0,5M 1mM 0,1ml H2O 49,4mll * Quy trình chiết tách
+ Bước 1: Thu mẫu lá cây khoẻ, cắt dài khoảng 2 cm, bỏ vào ống nghiệm có dung tích 1,5 ml, ñánh dấu tên giống rồi bỏ vào ñá lạnh.
+ Bước 2: Trong phòng thí nghiệm các cối sứ ñã ñược khử trùng ñặt trong ñá lạnh, các mẫu lá ñược cắt nhỏ 0,5 cm bỏ vào cối sứ.
+ Bước 3: Nhỏ 400 µl dung dịch chiết suất DNA vào cối sứ rồi lấy chầy nghiền nhỏ mẫu lá.
+ Bước 4: Nghiền nhỏ mẫu lá trong dung dịch chiết suất cho ñến khi dung dịch chuyển sang màu xanh ñen chứng tỏ tế bào lá ñã vỡ và diệp lục
ñược giải phóng ra.
+ Bước 5: ðổ thêm 400 µl dung dịch chiết suất DNA vào rồi trộn lẫn và chuyển 400 µl dung dịch này vào ống nghiệm ñã ñánh dấu cùng giống.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………48
+ Bước 6: ðổ vào ống nghiệm này 400µl Phenol: Chloroform: Isolamylalchohol (25:24:1). Sau ñó li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, 40C rồi chuyển phần dung dịch trên sang ống nghiệm ñã ñược ñánh dấu cùng giống.
+ Bước 7: ðổ thêm 400 µl Chloroform: Isolamyalchohol (24:1). Sau ñó li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, 40C rồi chuyển phần dịch phía trên sang ống nghiệm ñã ñược ñánh dấu cùng giống.
+ Bước 8: Cho 800 µl Ethanol 96%, trộn ñều sau ñó li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, 40C. ðổ dung dịch phía trên giữ lại phần kết tủa phía ñáy
ống nghiệm.
+ Bước 9: Rửa kết tủa bằng Ethanol 70 %, làm khô tự nhiên ở nhiệt ñộ
phòng.
+ Bước 10: Hoà tan kết tủa bằng 50 µl dung dịch TE rồi bảo quản ở
nhiệt ñộ - 200C.
Lấy 1 µl dung dịch DNA dùng cho mỗi phản ứng.
* Kiểm tra ñộ tinh sạch của DNA
Sau khi tách chiết DNA chúng tôi tiến hành kiểm tra ñộ tinh sạch của DNA. - Lấy 1µl DNA tổng số ñã ñược bảo quản trong TE + 7µl TE (ñể làm giảm bớt nồng ñộ DNA), trộn lẫn với 1µl loadingbuffer rồi nhỏ vào các giếng
ñiện di.
- Cắm vào nguồn ñiện 70V, 25 phút.
- Nhuộm bản gel bằng Ethillium bromide, trong 10 phút. - Quan sát các vệt băng bằng cách chiếu tia UV
DNA nguyên bản không bị gãy và không lẫn tạp khi xuất hiện vệt băng
ñồng ñều và rõ nét.
3.3.3.2 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR ( nh©n AND)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………49
Trình tự mồi sử dụng trong nhân gen PCR phát hiện gen kháng bệnh bạc lá lúa Xa4, xa5, Xa7.
Chỉ thị NST Trình tự mồi Gen liên
kết
Khoảng cách (cM)
Tài liệu tham khảo Npb181
Npb78 11 R5’-GTG-CTA-TAA-AAG-GCA-TTC-GGG-3’
F5’- ATC-GAT-CGA-TCT-TCA-CGA-GG-3’ Xa4 1,7 Yoshida
et al.
1992 RG556 5 R5’-AAT-ATT-TCA-GTG-TGC-ATC-TC-3’ F5’-TAG-CTG-CTG-CCG-TGC-TGT-GC-3’ Xa5 0-1 McCough 1991 et al
P3 6 R5’-CAT-CAC-GGT-CAC-CGC-CAT-ATC-GGA-3’ F5’-CAG-CAA-TTC-ACT-GGA-GTA-GTG-GTT-3’ Xa7 2,5 Taura 2003 et al Quy trình PCR xác ñịnh gen kháng bệnh bạc lá do GS.TS. S. Taura và ctv ñề xuất [56] * Thành phần cocktail sử dụng cho 1 phản ứng: Thành phần Nồng ñộ gốc Thể tích cần lấy (µl) H2O 13,3 PCR buffer (có chứa Mg2+) 10X 2,0 dNTP 2,5mM 1,6
Primer Forward 10pmol/µl 1,0
Primer Reverse 10pmol/µl 1,0
DNA taq polymerase 5 unit/µl 0,1
Tổng thể tích cocktail 19,0
DNA nguyên bản 1µl 1,0
Tổng thể tích 20µl
- Cho 19µl cocktai ñã pha chế vào mỗi ống.
- Cho tiếp 1µl DNA ñã chiết tách vào mỗi ống, ñậy nắp cẩn thận và Voltex nhẹ. - Phản ứng PCR ñược tiến hành theo chu trình nhiệt gồm 4 bước sau:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………50
Bước Nhiệt ñộ(oC) Thời gian (phút) Số chu kỳ
I 94 4 1 94 0,5 35-56 0,5 II 72 1 34 III 72 5 1 IV 4
* Quy trình nhân gen Xa4, Xa7
Bước Nhiệt ñộ (0c) Thời gian (phút)
1 94 4 2 94 1 3 56 1 4 72 2 5 Lặp lại 34 chu kỳ từ bước 2 6 72 8 7 4 8 END
* Quy trình nhân gen xa5
Bước Nhiệt ñộ (0c) Thời gian (phút)
1 94 4 2 94 1 3 60 1 4 72 1 phút và 50 giây 5 Lặp lại 34 chu kỳ từ bước 2 6 72 7 7 4 8 END
3.3.3.3 Phương pháp ñiện di sản phẩm PCR trên gel agarose
- Chuẩn bị gel agarosse 1,5% (1,5 g agarose + 100ml 1X TAE)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………51
ra dùng máy khuấy từ làm tan hoàn toàn, ñể nguội ñến khoảng 500C.
+ ðặt lược tạo giếng (dán băng dính vào khuôn ñể tránh rò rỉ gel), ñổ
dung dịch agarose vào khuôn và ñể nguội. Chú ý không ñể lại bọt khí ở ñáy lỗ
khuôn, khi gel ñông kết mới bỏ lược ra.
- Chạy ñiện di sản phẩm DNA nhân trong chu trình PCR
+ Sau khoảng 30 phút ñể gel ñông lại, bỏ băng dính ở ñầu cuối khuôn, tháo lược. ðặt khay khuôn gel vào bể ñiện di, ñổ dung dịch ñiện di ngập gel khoảng 4mm.
- Trải một mảng parafin, nhỏ 2µl loading bufet, trộn với 8µl sản phẩm PCR vào giếng.
- Cắm nguồn ñiện di một chiều (75V) chạy trong khoảng 25 ñến 30 phút. DNA mang ñiện tích âm sẽ chạy vềñiện cực âm của nguồn ñiện.
- Sau khi chạy ñiện di xong, nhuộm bản ñiện di bằng Ethilium Bromide nồng ñộ 10mg/ml trong 10 phút.
- Quan sát vệt băng bằng cách chiếu tia UV và chụp ảnh.
* Phát hiện gen kháng bạc lá
- ðối với gen Xa4 và Xa7, khi quan sát vệt băng ta thấy: vệt băng chứa ñối chứng dương sẽ chạy nhanh hơn vệt băng chứa IR24. Giếng nào tạo vệt thẳng hàng với ñối chứng dương chứng tỏ giống ñó chứa gen kháng tương ứng.
- ðối với gen xa5, khi quan sát sản phẩm PCR bằng ñèn UV ta không phân biệt ñược sự sai khác của các ñoạn ñược nhân lên giữa ñối chứng âm (IR24), ñối chứng dương (IRBB5) và các mẫu nghiên cứu. Do vậy, sản phẩm PCR ñược cắt bởi Enzyme cắt hạn chế (Enzyme DraI) ñể tạo ra sựña hình. Enzyme Nguồn vi sinh vật Trình tự nhận biết Loại ñầu
DraI Deinococcus radiophilus 5’- TTT↓AAA- 3’ ðầu bằng
3’- AAA↑TTT- 5’
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………52
STT Thành phần Nồng ñộ dung dịch Thể tích (µl)
1 Nước cất vô trùng 3,2
2 Buffer 10X 1,5
3 Enzym DraI 10U/µl 0,3
4 Sản phẩm PCR 10
5 Tổng thể tích 15
Hỗn hợp phản ứng ñược ủ trong tủ ñịnh ôn ở nhiệt ñộ 370C với thời gian từ 6 giờ -16 giờ.