3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2 Phương pháp lây nhiễm và ñ ánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá nhân
nhân tạo
- Lây nhiễm khi lúa ở giai ñoạn làm ñòng.
Bảng 3.2. Danh sách các chủng vi khuẩn sử dụng trong lây nhiễm
STT Isolate Phân lập từ
giống ðịa ñiểm thu thập Chủng
1 HAU 02036-1 Nếp tân Thuận Châu- Sơn La 2B
2 HAU 02008-3 Nhị ưu 838 Quỳnh Giang – Quỳnh Lưu – Nghệ An 3A
3 HAU 02013-1 Khang dân Diễn Kỳ – Diễn Châu – Nghệ An 5A
4 HAU 02019-1 Q5 Vĩnh Hồng – Bình Giang – Hải Dương 7
5 HAU 02037-1 IR64 Thuận Châu – Sơn La 9
6 HAU 02008-1 Nhị ưu 838 Quỳnh Giang – Quỳnh Lưu – Nghệ An 3A’
7 HAU 01008-1 Tẻ ñỏ Hải Dương 4
8 HAU 02034-6 Nhị ưu 838 Cường Thịnh – Yên Kỳ – Yên Bái 6
9 HAU 02020-1 Nếp thơm Vĩnh Hồng – Bình Giang – Hải Dương 8
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………45
Vi khuẩn ñược nuôi cấy trên môi trường Wakimoto, thành phần gồm: Khoai tây: 300,0(g) Ca(NO3)2.4H2O: 0.5 (g) Na2HPO4.4H2O: 2,0 (g) Pepton : 5,0 (g) Saccarose : 15,0 (g) Agar : 17,0 (g) PH = 6.8 - 7,0
- Cách nấu môi trường: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch bằng nước cất, thái mỏng, ñổ 50 ml nước cất vào ñun sôi trong 30 phút. Sau ñó lọc lấy dịch chiết khoai tây, thêm nước cất cho ñủ 1000 ml.
Cân các hoá chất còn lại, lần lượt ñổ vào dịch chiết khoai tây, vừa ñổ vừa khuấy ñều cho tan hết hoá chất. Sau khi ñun cách thuỷ xong, ta ñổ môi trường vào ống nghiệm và ñem hấp cách thuỷ ở 121,60C trong 15 phút. Trong khi hấp chú ý ñặt nghiêng ống nghiệm ñể tạo mặt môi trường nghiêng. Sau 4 - 8h môi trường ñông lại, tiến hành nuôi cấy vi khuẩn ngay hoặc có thể bảo quản.
- Phương pháp lây nhiễm
Sử dụng 9 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa do Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thuỷ, Yoshimura và Storu Taura phân lập năm 2002.
Vi khuẩn ñược dự trữ và bảo quản trong môi trường paraphin và môi trường Skim milk (- 300C).
Tạo dung dịch lây nhiễm: sau 48 giờ vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường Wakimoto mọc. Khi ñó lấy một vòng vi khuẩn hoà tan với 10ml nước tạo thành dung dịch vi khuẩn có nồng ñộ 108 CFU/ml. ðem dung dịch này ñi lây nhiễm.
Trước khi lây nhiễm tiến hành lây thử trên dòng nhiễm chuẩn IR24 ñể
thửñộc tính của vi khuẩn sau bảo quản.
Lây nhiễm bằng phương pháp cắt ñầu lá: dùng kéo ñã khử trùng nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh, cắt lên ñầu lá lúa khoảng 2 – 5 cm vào giai ñoạn làm ñòng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………46
- ðánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
Sau lây nhiễm 20 ngày, tiến hành ño chiều dài vết bệnh và ñánh giá theo GS. Satoru Taura chia ra: + Chiều dài vết bệnh: < 8cm - Kháng
+ Chiều dài vết bệnh: 8 - 12cm – Nhiễm vừa + Chiều dài vết bệnh: > 12cm - Nhiễm nặng