4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬ N
4.3.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR ñể xác ñị nh các Xa – gens
để phát hiện khả năng mang 3 gen kháng bạc lá Xa4, xa5, Xa7 của tập
ựoàn các giống lúa ựịa phương, chúng tôi tiến hành nhân gen bằng kỹ thuật PCR sử dụng 3 cặp mồi ựã nêu ở phần phương pháp. điện di sản phẩm, sau ựó so sánh băng ựiện di của từng giống với băng ựiện di của các dòng ựẳng gen, nếu giống nào có băng ựiện di tương tự như dòng ựẳng gen mang gen kháng thì kết luận giống ựó cũng mang gen kháng tương tự.
Một số hình ảnh ựiện di xác ựịnh các Xa Ờ gens kháng
Hình 4.5. Kết quảựiện di xác ựịnh gen Xa4
M: marker, giếng 1: IR24, giếng 2: IRBB4, giếng 3: 10057, giếng 4: 10068, giếng 5: 10172, giếng 6: 10095, giếng 7: 10098, giếng 8:10103, giếng 9: IRBB4. Các giếng 3, 4, 5, 6, 8, tương ứng với các giống 10057, 10068, 10072, M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 200 bp 150 bp
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ99
10095, 10103, trùng với vệt băng của IRBB4 (ựoạn DNA nhân lên có kắch thước là 150bp) chứng tỏ các giống này mang gen Xa4. Các giếng còn lại có vệt băng trùng với IR24 là những giống không mang gen Xa4.
Hình 4.6. Kết quảựiện di sản phẩm PCR cho gen xa5 trước khi cắt enzyme
Giếng 1- IR24, giếng 2 Ờ IRBB5, giếng 3 Ờ 10163, giếng 4 Ờ 10165, giếng 5 -10167, giếng 6 -10168, giếng 7- 10169, giếng 8 -10171, giếng 9 Ờ 10173, giếng 10 Ờ 10618, giếng 11 Ờ10646, giếng 12 Ờ 10668.
Hình 4.7. Kết quảựiện di xác ựịnh gen xa5 sau khi cắt emzyme
M: marker, Giếng 1- IR24, giếng 2 Ờ IRBB5, giếng 3 Ờ 10163, giếng 4
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ100
Ờ 10165, giếng 5 -10167, giếng 6 -10168, giếng 7- 10169, giếng 8 -10171, giếng 9 Ờ10173, giếng 10 Ờ 10618, giếng 11 Ờ10646, giếng 12 Ờ 10668, giếng 13 Ờ10675, giếng 14 Ờ 10678, giếng 15 Ờ10699.
Giếng 12 tương ứng với giống 10668 có vệt băng trùng với vệt băng của IRBB5 chứng tỏ các giống này mang gen xa5. Các giếng còn lại có vệt băng trùng với IR24 là những giống không mang gen xa5.
Hình 4.8. Kết quảựiện di xác ựịnh gen Xa7
Giếng 1- IRBB7, giếng 2 Ờ IR24, giếng 3 Ờ 10124, giếng 4 - 10128, giếng 5 Ờ 10137, giếng 6 Ờ 10144, giếng 7 -10153, giếng 8- 10156, giếng 9 - 10168.
Các giếng 3, 4, 5, 6, 8, 9 tương ứng với các giống 10124, 10128, 10137, 10144, 10156, 10168 có vệt băng trùng với vệt băng của IRBB7 (ựoạn DNA nhân lên có kắch thước là 200bp) chứng tỏ các giống này mang gen
Xa7. Giếng 7 có vệt băng trùng với IR24 là giống không mang gen Xa7. Sau khi chạy ựiện di và quan sát vệt băng, chúng tôi thu ựược kết quả ở bảng 4.16.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ101
Bảng 4.16. Kết quả chạy PCR tìm gen kháng bệnh bạc lá Giống Xa4 xa5 Xa7 Giống Xa4 xa5 Xa7
10055 - - - 10176 - + - 10057 + - - 10179 - - - 10068 + - - 10273 - - + 10072 + - 10279 + - - 10090 + - - 10282 + - + 10094 + - - 10285 - - + 10095 + - - 10292 - - - 10098 - - + 10590 - + + 10100 + - - 10618 - - + 10103 + - - 10640 - - + 10105 + - - 10641 - - + 10107 - - - 10646 + - - 10108 - - + 10654 - + - 10113 - - - 10668 - + - 10124 - - + 10675 + - - 10128 - - + 10678 - - + 10137 + - + 10681 - + + 10144 - - + 10685 - + + 10153 - - - 10698 - + - 10156 - - + 10699 - - + 10163 + - - 10158-1 - - + 10165 - - - 10280- 2 - - + 10167 + - - IR24 - - - 10168 - - + IRBB4 + - - 10169 - - + IRBB5 - + - 10171 + - - IRBB7 - - + 10173 + - + Chú thắch: + Có gen kháng - Không có gen kháng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ102
Qua bảng 4.16 cho thấy:
Có 18 giống mang gen Xa4 ựó là 10057, 10068, 10072, 10090, 10094, 10095, 10100, 10103, 10105, 10137, 10163, 10167, 10171, 10173, 10279, 10282, 10646, 10675.
Có 23 giống mang gen Xa7 ựó là 10098, 10108, 10124, 10128, 10137, 10144, 10156, 10158-1, 10168, 10169, 10173, 10273, 10280-2, 10282, 10285, 10590, 10618, 10640, 10641, 10678, 10681, 10685, 10699.
Có 7 giống mang gen xa5 ựó là: 10176, 10590, 10654, 10668, 10681, 10698, 10685.
Có 3 giống mang cả 2 gen Xa4 và Xa7ựó là 10137, 10173, 10282. Có 3 giống mang cả 2 gen xa5 và Xa7ựó làn 10590, 10681, 10685. Qua quá trình chạy PCR tìm gen kháng bệnh bạc lá chúng tôi thấy ựây thực sự là nguồn gen rất quý cho công tác chọn tạo giống chống bệnh bền vững.
* Từ bảng ựánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá và kết quả ựiện di xác ựịnh các Xa Ờ genes ta có một số nhận xét sau:
- Những giống không chứa gen kháng thì hầu hết bị nhiễm hoàn toàn với 7 chủng lây nhiễm.
- đa số các giống mang gen Xa4 ựều có phản ứng nhiễm với chủng 7, 4, 5A, 3AỖ, 8 chứng tỏ gen Xa4 không có khả năng kháng 5 chủng này.
- Phản ứng của các giống mang gen Xa7 với các chủng vi khuẩn ựem lây nhiễm thấy: Hầu hết các giống mang gen Xa7 ựều có phản ứng nhiễm với chủng 5A, 7, 9, 3AỖ. Các giống mang gen Xa7 tỏ ra kháng tương ựối với chủng 4.
- Phản ứng của các giống mang gen xa5 với các chủng vi khuẩn ựem lây nhiễm:
Qua ựánh giá khả năng kháng của các giống tham gia thắ nghiệm với các chủng vi khuẩn thì hầu hết các giống mang gen xa5 ựều có phản ứng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ103
kháng với tất cả các chủng vi khuẩn lây nhiễm.
Như vậy, từ kết quả ựánh giá khả năng kháng các chủng vi khuẩn bằng lây nhiễm nhân tạo và kết quả chạy ựiện di tìm gen kháng Xa4, xa5, Xa7 của các giống tham gia thắ nghiệm thấy:
Nhìn chung, với những giống mang gen Xa4 và Xa7 nếu chỉ có một gen ựơn lẻ thì khả năng kháng với 6 chủng 5A, 7, 9, 3AỖ, 6, 8 là không cao, kháng tương ựối với chủng 4. Tuy nhiên có 7 giống 10646 (Xa4),10675 (Xa4), 10168(Xa7) ,10640(Xa7), 10641(Xa7), 10699 (Xa7), 10580-1 (Xa7) chỉ mang gen kháng ựơn lẻ nhưng khả năng kháng với 7 chủng là rất tốt, có thể những bị lẫn giống hay có chứa gen kháng bệnh bạc lá khác.
Nhưng nếu giống nào mang tổ hợp 2 gen kháng Xa4/Xa7 hay Xa7/ xa5 thì phản ứng kháng với cả 7 chủng ựược biểu hiện rất rõ.
Qua ựánh giá thấy khả năng kháng của những giống mang gen xa5
với những giống mang tổ hợp 2 gen kháng Xa4/Xa7và xa5/Xa7 là xấp xỉ nhau. Do ựó, thay vì việc tổ hợp nhiều kháng vào một giống ta chỉ cần ựưa một gen kháng xa5 cũng ựủ khả năng kháng 7 chủng vi khuẩn này.
Vì vậy, trước khi ựem một giống về trồng ở ựịa phương nào ựó thì ta nên xác ựịnh các chủng vi khuẩn có mặt tại vùng sinh thái ựó trước, sau ựó mới lựa chọn nên dùng những giống chứa gen kháng hữu hiệu nào ựể cho hiệu quả kháng bệnh cao nhất.
4.4 Giới thiệu một số giống triển vọng
* Qua ựề tài này, khi tiến hành khảo sát ựặc ựiểm nông sinh học của 49 giống lúa nếp ựịa phương mới thu thập, chúng tôi thấy 4 giống triển vọng, có năng suất tiềm năng khá và mang gen kháng bệnh bạc lá thể hiện ở bảng 4.17.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ104 Bảng 4.17. Giới thiệu một số giống có tiềm năng năng suất cao Giống Thời gian sinh trưởng (ngày) Chiều cao cây(cm) Số bông hữu hiệu/ khóm Số hạt/ bông Tỷ lệ hạt chắc (%) KL 1000 hạt (g) Năng suất lý thuyết (tạ/ha) Chất lượng cơm Kháng nhiễm bệnh nhân tạo (R/M/S) Chứa gen 10167 125 113,2 8,6 127,0 76,9 24,6 82,1 thường Bình 6/0/2 Xa4 10168 145 130,8 5,6 138,0 75,5 33,0 86,6 thường Bình 9/0/0 Xa7 10171 136 96,2 9,8 114,8 70,1 26,0 92,3 thường Bình 3/5/0 Xa4 10144 135 102,8 6,2 201,8 56,0 29,0 91,2 thường Bình 4/2/2 Xa7 TK90 143 126.2 7,0 132,6 79,5 24,3 80,7 Bình thường Qua bảng 4.17 thấy các giống triển vọng có:
+ Thời gian sinh trưởng thuộc nhóm ngày ngắn ựến trung bình (dao
ựộng từ 125 ngày Ờ 145 ngày) tương ựương với ựối chứng TK90.
+ Chiều cao cây từ trung bình ựến cao (dao ựộng trong khoảng 96,2 cm Ờ 130,6 cm). Trong ựó 3 giống có chiều cao cây thấp hơn ựối chứng TK90 (126cm), một giống có chiều cao cây tương ựương với ựối chứng. Khả năng chống ựổ tốt hơn ựối chứng.
+ Số bông hữu hiệu trên khóm của các giống triển vọng dao ựộng từ 5,6 Ờ 9,8 bông trên khóm, còn ựối chứng TK90 có số bông hữu hiệu/ khóm là 7 bông/khóm.
+ Số hạt trên bông khá tương ựương và cao hơn ựối chứng (từ 114,8
ựến 201,8 hạt).
+ Có năng suất lý thuyết cao hơn ựối chứng TK90.
+ Có khả năng kháng 9 chủng lây nhiễm từ trung bình ựến khá. + Có mang gen kháng bệnh bạc lá.
* Qua ựánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá nhân tạo và xác ựịnh khả năng chứa gen kháng Xa4, xa5, Xa7 chúng tôi thấy có 10 giống
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ105
thể hiện ở bảng 4.18 biểu hiện kháng tốt khi lây nhiễm 9 chủng vi khuẩn và có mang gen kháng bệnh bạc lá.
Bảng 4.18. Giới thiệu một số giống có khả năng kháng bệnh tốt khi lây nhiễm nhân tạo và chứa gen kháng bệnh bạc lá
Chủng
Giống 2B 3A 5A 7 9 3AỖ 4 6 8 R/M/S Tỷ lệ Chứa gen
10137 R R R R R - R R R 8/0/0 Xa4, Xa7 10173 R R R R R - R R - 7/0/0 Xa4, Xa7 10282 - R R R R R R R R 8/0/0 Xa4, Xa7 10590 R R R R R R R R R 9/0/0 xa5, Xa7 10681 R R R R R R R R R 9/0/0 xa5, Xa7 10685 R R R R R R R R R 9/0/0 xa5, Xa7 10698 R R R R R R R R R 9/0/0 xa5 10654 R R R R R R R R R 9/0/0 xa5 10668 R R R R R R R R R 9/0/0 xa5 10176 R R R R R R R R R 9/0/0 xa5
đây là nguồn vật liệu quan trọng và có ý nghĩa trong công tác chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá bền vững.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ106
5. KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ
Qua quá trình ựánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của 49 giống lúa nếp ựịa phương bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo kết hợp với phương pháp PCR ựồng thời khảo sát một số ựặc ựiểm nông sinh học liên quan ựến năng suất lúa và khả năng kháng bệnh chúng tôi rút ra một số kết luận và ựề
nghị sau:
5.1 Kết luận
1. Qua khảo sát một sốựặc ựiểm nông sinh học của các giống tham gia thắ nghiệm chúng tôi rút ra ựược 4 giống có tiềm năng năng suất triển vọng 10167, 10168, 10171, 10144, có ựặc ựiểm nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất tốt, thời gian sinh trưởng thuộc nhóm ngày ngắn ựến trung bình, năng suất lý thuyết tương ựương và cao hơn ựối chứng TK90. đặc biệt là có mang gen kháng bệnh bạc lá.
2. Qua ựánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá nhân tạo ựã xác
ựịnh ựược 19 giống có khả năng kháng tương ựối với 7 chủng lây nhiễm (trừ
2 chủng mất hoạt tắnh) trong ựó 15 giống thể hiện kháng hoàn toàn với cả 7 chủng. Có 2 giống kháng ựược 6 chủng. Có 2 giống kháng ựược 5 chủng.
- Qua ựánh giá mức ựộ ựộc tắnh của các chủng vi khuẩn thấy: Trong 7 chủng vi khuẩn bạc lá lây nhiễm (trừ 2 chủng mất hoạt tắnh) chủng 7 có ựộc tắnh mạnh nhất, tỷ lệ kháng/nhiễm của các giống thắ nghiệm với chủng này là 19R/4M/27S. Chủng 4 tỷ lệ kháng nhiễm ựạt 29R/12M/9S, là chủng có ựộc tắnh nhẹ nhất, có 29 giống biểu hiện kháng ựược chủng này.
3. Tìm ựược 18 giống mang gen Xa4, 23 giống mang gen Xa7, 7 giống mang gen xa5, 3 giống có chứa cả 2 gen Xa4 và Xa7, 3 giống có chứa cả 2 gen xa5 và Xa7.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ107
5.2 đề nghị
1. Trong quá trình thực hiện ựề tài này chúng tôi chỉ lây nhiễm 9 chủng vi khuẩn mà 2 chủng lại mất hoạt tắnh, do vậy chúng tôi ựề nghị phân lập lại 2 chủng mất hoạt tắnh và tiếp tục ựánh giá khả năng kháng nhiễm của các giống lúa thắ nghiệm với 2 chủng mất hoạt tắnh cùng một số chủng gây bệnh khác ở
các vụ tiếp theo.
2. đưa 4 giống triển vọng có ựặc ựiểm nông sinh học tốt và chứa gen kháng bệnh bạc lá ựi khảo nghiệm và ựánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá ở những vụ tiếp theo.
3. Sử dụng 10 giống chứa gen kháng hữu hiệu xa5; Xa4/Xa7; xa5/Xa7
làm vật liệu chuyển gen kháng bạc lá vào những giống có tiềm năng năng suất cao và chất lượng tốt mà không có khả năng kháng bệnh bạc lá ựể tạo giống kháng bệnh bền vững.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ108
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu trong nước
1. Bùi Chắ Bửu, Nguyễn Thị Lang (2005), Cải tiến giống cây trồng bằng ứng dụng chỉ thị phân tử.
2. đường Hồng Dật (1998), Lời giới thiệu hướng dẫn nghiên cứu bệnh vi khuẩn thực vật (Hà Minh Trung và Nguyễn Văn Thành dịch), NXB Hà Nội.
3. Nguyễn đình Giao, Nguyễn Thiện Huyên, Nguyễn Hữu Tề, Hà Công Vượng, 2001, Giáo trình cây lương thực, tập I, NXB NN, Hà Nội 4. Nguyễn Văn Hiển và cs (2002), Giáo trình chọn giống cây trồng, NXB
Giáo Dục.
5. Nguyễn Văn Hoan (1991), Giống lúa ngắn ngày đH 60, Kỷ yếu nghiên cứu khoa học 35 năm ngày thành lập Trường đại học Nông nghiệp I Hà Nội, NXB Nông nghiệp Hà nội.
6. Vũ Công Khoái (2000), Nghiên cứu bệnh bạc lá lúa hại trên giống lúa lai và lúa thuần, Luận án thạc sĩ , đại học Nông nghiệp I Ờ Hà Nội, tr. 3 Ờ 20.
7. K.E.Mucller, Những thiệt hại trên ruộng lúa nhiệt ựới (Hà Văn Chức dịch) Ờ IRRI,1983.
8. Nguyễn Thị Lan (2005) Ờ Bài giảng cao học phần cây lương thực.
9. đoàn Thị Lương, Ứng dụng chỉ thị PCR nhằm phát hiện và ựánh giá nguồn gen kháng bệnh bạc lá lúa Xa Ờ 7, Xa Ờ 21, Báo cáo tốt nghiệp 2005.
10. Vũ Triệu Mân, Lương Tề (1999), Bệnh vi khuẩn, vi rút hại cây nông nghiệp, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr. 183 Ờ 184.
11. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (2001), Giáo trình bệnh cây Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr.183 Ờ 184.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ109
12. O.U.S.H, Bệnh hại lúa, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 1983.
13. Phương pháp PCR - Diễn ựàn đại học Nông nghiệp Hà Nội, http://hau1. info/forum/showthread.php (2007).
14. Phạm Văn Phượng (2006). Ứng dụng kỹ thuật ựiện di protein SDS-Page
ựể nghiên cứu ựặc ựiểm di truyền và chọn giống lúa. Luận án tiến sĩ
Nông nghiệp, Cần thơ -2006.
15. Quy phạm khảo nghiệm giống lúa, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2004.