II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.6.3 Chẩn ựoán huyết thanh học
2.6.3.1. Phản ứng trung hoà vi-rút
Phản ứng này dùng chẩn ựoán các trường hợp bị bệnh nhẹ, không ựiển hình, phải lấy máu chắt huyết thanh ựể tìm kháng thể. Phản ứng này rất ựặc hiệu, nhạy và nhanh chóng. Việc tìm ra kháng thể ựặc hiệu ở gia súc chưa ựược tiêm phòng vacxin LMLM ựủ cơ sở kết luân là con vật có bệnh.
Kháng nguyên là virut LMLM chuẩn nuôi cấy trên môi trường IB Ờ RS Ờ 2, BHK Ờ 21, tế bào thận lợn hoặc thận cừu và gây bệnh tắch tế bào. Kháng thể nghi là huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh ựược xử lý ở nhiệt ựộ 560C trong 30 phút.
Phản ứng trung hòa virut ựược thực hiện trên môi trường tế bào IB-RS- 2, BHK-21, tế bào thận lợn hoặc thận cừu ựược nuôi trong các ựĩa nhựa lỗ nhỏ ựáy bằng. để xác ựịnh typ gây bệnh, cho huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh vào 7 ống nghiệm, sau ựó cho vào ống nghiệm từng typ virut LMLM ựã biết với hiệu giá virut ựã ựược xác ựịnh là 100 TCID50 (50% Tissue Culture Infectious Dose) một lượng tương ựương với huyết thanh nghi, rồi cho vào tủ ấm 370C trong khoảng 1 giờ ựể kháng nguyên và kháng thể tác ựộng vào nhau. Sau ựó dùng hỗn dịch của từng ống nghiệm cấy vào các dãy lỗ nhựa ựã nuôi cấy tế bào, ựồng thời các lỗ ựối chứng âm không cấy hỗn dịch mà ựể tế bào tiếp tục phát triển và các lỗ ựối chứng dương cấy các týp virut LMLM tiếp tục ựể tủ ấm 370C trong vòng 2-3 ngày.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 21
đọc kết quả, nếu lỗ ựĩa nhựa nào không có hiện tượng hủy hoại tế bào, giống như lỗ ựối chứng âm, chứng tỏ lỗ ựó có kháng thể tương ứng với týp virut LMLM nên virut bị kháng thể trung hòa và không có khả năng hủy hoại tế bào. Ngược lại, nếu lỗ ựĩa nào có hiện tượng hủy hoại tế bào, tức là ở ựó virut vẫn còn khả năng gây bệnh, giống lỗ ựối chứng dương, chứng tỏ kháng thể không tương ứng với týp virut ựó hoặc trong huyết thanh không có kháng thể.
2.6.3.2. Phản ứng kết hợp bổ thể (CFT- Complement Fixation Test)
Phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng thông thường ựược dùng ựể phát hiện bệnh LMLM, vì ựơn giản, cho kết quả nhanh, chắnh xác và ắt tổn kém.
Nguyên lý: Dùng các typ huyết thanh ựã biết ựể phát hiện týp virut gây bệnh (Nguyễn Như Thanh, 2001). Phản ứng kết hợp bổ thể ựược thực hiện nhờ hai hệ thống: hệ thống dung huyết và hệ thống dung trùng với sự tham gia của bổ thể.
Huyết thanh miễn dịch ( huyết thanh chuẩn) cua từng typ ựược chế trên chuột lang bằng phương pháp gây tối miễn dịch. Kháng nguyên nghi là huyết thanh gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc dùng bệnh phẩm cấy vào môi trường phù hợp, sau ựó lấy dịch ựể làm phản ứng.
2.6.3.3. Phản ứng ELISA (Enzyme Link Immonosorbent Assay)
Theo tác giả Tô Long Thành, ELISA là một phản ứng dùng ựể chẩn ựoán nhanh bệnh LMLM và ựể giám ựịnh týp huyết thanh của virut LMLM. đây là một phản ứng có ựộ ựặc hiệu cao khi dùng với một kháng thể ựơn dòng, phản ứng này có ựộ nhạy cao trong chẩn ựoán và ựịnh týp virut (Have P.,1987); (Hamblin C., và cộng sự, 1987) . Phản ứng ELISA cũng thường ựược sử dụng hơn so với phản ứng kết hợp bổ thể vì nó có ựộ ựặc hiệu và ựộ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 22
nhạy cao hơn, không bị ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường hoặc ức chế bổ thể (Nguyễn đăng Khải và cs, 2000) .
Nguyên lý: Phản ứng ELISA dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, rồi cho cơ chất vào. Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym không bị rửa trôi, enzym sẽ phân giải cơ chất tạo lên màu, khi màu trong quang phổ kế sẽ ựịnh lượng ựược mức ựộ phản ứng.
Trong ựó có:
- Phản ứng ELISA trực tiếp dùng ựể phát hiện kháng nguyên
- Phản ứng ELISA gián tiếp dùng ựể phát hiện kháng thể
Hiện nay, trong xét nghiệm chẩn ựoán thường sử dụng phản ứng 3ABC Ờ ELISA ựể chẩn ựoán phân biệt huyết thanh dương tắnh là do nhiễm virut tự nhiên hay do vacxin. Cơ sở khoa học của phương pháp này là virut LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc móng guốc chẵn, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra. Trong quá trình này, virut vừa tạo ra các thành phần ựể tái tạo các hạt virut mới (các virion), vừa tạo ra các thành phần không tham gia tạo thành các hạt virion mà chỉ ựóng vai trò là các men giúp cho quá trình nhân lên của virut. Các thành phần kết hợp thành bản than virut có tắnh kháng nguyên gọi là protein cấu trúc (structure protein). Các thành phần không tham gia kết hợp thành virion mới và có tắnh kháng nguyên gọi là protein không cấu trúc (non Ờ structure protein). Trong các hạt protein không cấu trúc của virut LMLM thì kháng nguyên 3ABC có tắnh kháng nguyên rất cao, nó kắch thắch cơ thể gia súc tạo ra kháng thể ựặc hiệu với số lượng lớn và tổn tại nhiều tháng trong huyết thanh trâu bò bị nhiễm. Do ựó việc phát hiện kháng thể ựặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc ựã bị nhiễm virut LMLM (Nguyễn Tùng, 2003).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 23
Tuy nhiên, trong các loại vacxin vô hoạt LMLM của các hãng Intervet (Hà Lan) và Merial (Pháp) những kháng nguyên không cấu trúc ựã ựược loại bỏ (gọi là vacxin tinh khiết). Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kắch thắch cơ thể sản sinh ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt virut) chứ không có kháng thể chống lại kháng nguyên không cấu trúc 3ABC.
Một số loại vacxin khác (vacxin ựơn týp O và hai týp O- Asia1 của Trung Quốc) là vacxin không tinh khiết. Do ựó dùng phản ứng 3ABC Ờ ELISA sẽ không xác ựịnh chắn chắn gia súc nhiễm virut LMLM thực ựịa hay do tiêm vacxin không tinh khiết. Việc kết luận gia súc mắc bệnh hay do tiêm vacxin Trung Quốc phải kết hợp với xét nghiệm bằng phản ứng trung hòa virut và ựiều tra lịch sử tiêm phòng vacxin (Tô Long Thành, 2000).