III. NỘI DUN GỜ NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2. Phương pháp xét nghiệm
Tất cả các mẫu huyết thanh ựược xét nghiệm lần ựầu bằng phản ứng 3ABC Ờ ELISA ựể xác ựịnh kháng thể sinh ra do nhiễm virut tự nhiên (ựể phân biệt kháng thể do nhiễm tự nhiên hay do tiêm phòng vacxin).
Tất cả mẫu huyết thanh dương tắnh với phản ứng 3ABC - ELISA sẽ ựược xét nghiệm tiếp bằng phản ứng Liquid Phase Blocking ELISA (LPB Ờ ELISA) ựể xác ựịnh typ huyết thanh. Các typ huyết thanh lưu hành tại Việt Nam gồm typ O, A, Asia1. Tuy nhiên trong chương trình giám sát Quốc gia chỉ tiến hành xét nghiệm kháng thể kháng các týp O, A là 2 typ phổ biến hơn.
3.4.2.1. Phương pháp xét nghiệm bằng phản ứng 3ABC - ELISA
* Các bước tiến hành xét nghiệm:
- đĩa ELISA ựược phủ kháng nguyên 3ABC của virut LMLM, kháng nguyên có ựộ tinh khiết cao ựược sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp.
- Pha loãng huyết thanh với tỷ lệ 1:100.
Mẫu huyết thanh trâu, bò cần chẩn ựoán, huyết thanh ựối chứng dương, huyết thanh ựối chứng âm chuẩn ựược pha loãng theo tỷ lệ 1:100 bằng dung dịch CHEKIT Ờ 3ABC Ờ Sample Ờ Diluent. Cho 100ộl/giếng vào 96 giếng
Ủ ở 370C trong 1 giờ. Phức hợp kháng nguyên 3ABC Ờ kháng thể kháng 3ABC sẽ ựược tạo thành nếu trong huyết thanh có kháng thể kháng 3ABC. Rửa
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
bằng dung dịch CHEKIT Ờ Washing với lượng 300ộl/giếng, rửa 3 lần ựể loại bỏ phẩn kháng thể 3ABC thừa.
- Gắn conjugate, tỷ lệ 1: 200.
+ 55ộl CHEKITỜAnti-IgG-PO-Conjugate + 11ml CHEKIT- Washing&Dilution- Solution.
+ Cho 100ộl dung dịch trên/giếng, ủ ở 370C trong 60 phút, sau ựó rửa 3 lần thấm khô.
- Cho cơ chất: Cho 100ộl CHEKIT Ờ Chromogen, ủ ở nhiệt ựộ phòng 20- 30 phút.
- Dừng phản ứng: Cho 50ộl Stopping Ờ Slution/giếng ựể nhiệt ựộ phòng. - đọc kết quả phản ứng bằng máy ựọc ELISA ở bước song 405nm.
N N 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39 A P P 8 8 Ầ Ầ Ầ Ầ Ầ Ầ Ầ Ầ B 1 1 Ầ Ầ C 2 2 D 3 3 E 4 4 F 5 5 45 45 G 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 46 46 H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
Ghi chú: (+) = Kháng nguyên, N = đối chứng âm, P = đối chứng dương Số: 1, 2, Ầ46: mẫu huyết thanh xét nghiệm
- đánh giá kết quả theo công thức:
ODsample Ờ ODneg
Giá trị% (% OD) = X 100%
ODpos Ờ ODneg Trong ựó ODsample = của mẫu xét nghiệm. ODpos = ựối chứng dương
ODneg = ựối chứng âm
Mẫu dương tắnh khi OD > 30%, mẫu âm tắnh khi OD < 20%, mẫu nghi ngờ khi 20% <OD < 30%.
3.4.2.2. Phương pháp xét nghiệm bằng phản ứng LPB - ELISA Các bước tiến hành:
Mỗi typ virut LMLM sẽ ựược kiểm tra trên từng ựĩa phản ứng riêng. Phản ứng ựược tiến hành theo sơ ựồ ựĩa phản ứng sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33 B C++ C++ 2 2 ... ... C C+ C+ 3 3 D C+ C+ 4 4 E C- C- 5 5 F C- C- 6 6 G Ca Ca 7 7 H Ca Ca 8 8 ... 40 40
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Chú thắch:
C++ : Huyết thanh ựối chứng dương mạnh C+ : Huyết thanh ựối chứng dương yếu C- : Huyết thanh ựối chứng âm
Ca : đối chứng kháng nguyên
1, 2,... 40 : Huyết thanh trâu, bò cần kiểm tra - Phủ ựĩa (coating)
Chuẩn bị kháng thể thỏ kháng virut LMLM tương ứng với các typ O và A. Pha loãng mỗi loại kháng thể thở tương ứng với từng typ O và A trong dung dịch Coating buffer theo tỷ lệ 1:500. Tắnh lượng dung dịch pha loãng ựủ dùng cho số ựĩa ELISA sử dụng cho phản ứng. Nghĩa là mỗi ựĩa ELISA cần Coat 5ml kháng thể thỏ pha loãng thì khi pha cần dư thêm 1ml.
- Nhỏ vào tất cả các giếng của ựĩa ELISA, mỗi giếng 50ộl kháng thể thỏ pha loãng.
- đậy nắp, ủ và lắc ựĩa trong tủ ấm 370C/1 giờ hoặc ủ qua ựêm ở 40C. - Chuẩn bị hỗn hợp kháng nguyên Ờ huyết thanh (liquid phase blocking). đây thực chất là pha trung hoà trên ựĩa nhựa polypropylen 96 giếng ựáy chữ U
- Các loại huyết thanh ựối chứng (C++, C+, C-) và huyết thanh cần kiểm tra ựược pha loãng theo tỷ lệ 1:16 với Buffer A, 50ộl/giếng
- Kháng nguyên virut LMLM chuẩn typ O và A ựược pha loãng trong Buffer A theo tỷ lệ cho trước. Ủ hỗn hợp qua ựêm ở 40C.
- Rửa ựĩa ELISA 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002M
- Chuyển 50ộl hỗn hợp kháng nguyên Ờ huyết thanh từ ựĩa chữ U sang ựĩa ELISA theo vị trị tương ứng. đậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt ựộ 370C/1 giờ.
- Rửa ựĩa 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M.
- Nhỏ kháng thể phát hiện: Kháng huyết thanh chuột lang kháng virut LMLM phan loãng 1:100 với buffer B, 50ộl/giếng.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
- Rửa ựĩa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002M
- Nhỏ Conjugate ựược pha loãng theo tỉ lệ 1:200 bằng Buffer B, 50ộl/giếng. đậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt ựộ 370C/40 phút.
- Rửa ựĩa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002M
- Nhỏ substrate chromogen (dung dịch chromogen +5% substrate 50ộl/ giếng. để 20 phút trong nhiệt ựộ phòng, chỗ tối.
- Dừng phản ứng: nhỏ mỗi giếng 50ộl dung dịch H2SO4 1,25M ựể dừng phản ứng.
đọc kết quả phản ứng.
đọc kết quả phản ứng trên máy ựọc ELISA Titertek Multiskan Plus MKII, kắnh lọc 492nm. Sử dụng phần mềm EDI ựể tắnh PI (Percentage Inhibition).
- Công thức tắnh PI :
ODmẫu huyết thanh kiểm tra
PI = 100 Ờ x 100 ODtrung bình kháng nguyên ựối chứng
+ Nếu PI ≥ 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra ựược coi là dương tắnh, kết luận trong kiểm tra có kháng thể LMLM.
+ Nếu PI < 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra ựược coi là âm tắnh, kết luận trong huyết thanh kiểm tra không có kháng thể LMLM.
Khi ựịnh lượng kháng thể: Hiệu giá kháng thể ≥ 1/128: ựạt bảo hộ