3. ðỐ IT ƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.3.2.1 Phương pháp nấu môi trường
* Môi trường PGA (Potato- Glucose- Agar)
Thành phần: + Khoai tây 200 g + Glucose 20 g + Agar 20 g + Nước cất 1000 ml
Cách ñiều chế: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, thái lát mỏng cho vào nồi cùng với 1000 ml nước cất ñun sôi khoảng 1 giờ. Lọc qua vải lọc, bổ sung
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………35
nước cất cho ñủ 1000 ml. Cho agar và glucose vào khuấy ñều cho agar tan hết, ñun cho ñến khi sôi. Cho môi trường này vào bình tam giác ñậy nắp bằng giấy bạc, sau ñó ñem hấp khử trùng ở 1210C (1,5 atm) trong vòng 45 phút. ðể
nguội 55 - 600C trước khi rót ra ñĩa petri ñã khử trùng [26]. * Môi trường WA (Water Agar)
Thành phần: +Agar 20 g
+ Nước cất 1000 ml Cách ñiều chế: tương tự như môi trường PGA
3.3.2.2 Phương pháp phân lập nấm
Chọn những mẫu bệnh còn tươi mới, có triệu chứng ñiển hình ñem về
phòng thí nghiệm rửa sạch dưới vòi nước sau ñó dùng giấy thấm khô rồi khử
trùng bề mặt bằng cồn 960. Cắt mô bệnh thành từng miếng nhỏ 1 – 2 mm (chứa cả phần mô bệnh và phần mô khoẻ) ñể cấy lên môi trường. Sau 3 – 4 ngày, chọn tản nấm phát triển tốt, cấy truyền sang môi trường PGA (cấy truyền khoảng 4 – 5 lần cho ñến khi thu ñược nấm thuần (Isolate).
Kiểm tra vi sinh vật gây bệnh bằng kính hiển vi, xác ñịnh ñặc ñiểm hình thái, mầu sắc, kích thước của tản nấm, cành bào tử, bào tử phân sinh và các cơ quan sinh sản của nấm [26].
3.3.2.3 Phương pháp thu thập mẫu hạt giống lạc
Lấy mẫu hạt giống tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An: Chọn 3 xã có diện tích trồng lạc lớn, có ñịa thếñất, công thức luân canh, mật ñộ gieo trồng và ñiều kiện sinh thái ñại diện cho vùng, mỗi xã thu thập 09 mẫu từ 09 nông hộ. Mẫu thu ñược trộn theo xã, trộn tiếp theo huyện thành mẫu tổng hợp, lấy mẫu phân tích từ mẫu tổng hợp, lượng mẫu phân tích là 500 gam củ hoặc 300g hạt giống.
3.3.2.4 Phương pháp giám ñịnh bệnh hại trên hạt giống lạc
* Chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu hạt giống của vụ xuân 2008 và tiến hành thí nghiệm vào vụ xuân 2009.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………36
* Giám ñịnh nấm gây hại hạt giống theo tài liệu giám ñịnh bệnh hại hạt giống của Viện nghiên cứu bệnh hạt giống ðan Mạch (Mathur S.B và Olga K., 2001), kiểm tra nấm bệnh tồn tại trên hạt giống bằng phương pháp giấy thấm.
* Phương pháp chia mẫu: mẫu hạt giống ñược trải ñều trên mặt phẳng theo hình tròn. Chia mặt phẳng làm 4 phần ñều nhau. Lấy mỗi phần một lượng nhất ñịnh sau ñó trộn ñều sao cho ñủ lượng mẫu kiểm tra. Lượng mẫu kiểm tra: 200 hạt.
* Phương pháp giám ñịnh bệnh hại trên hạt giống bằng phương pháp giấy thấm: ðặt 10 hạt trên giấy thấm ñã ñược làm ẩm bằng nước cất vô trùng trong ñĩa petri ñã ñược khử trùng. Sau ñó ñặt chúng trong phòng ủ ñảm bảo 12 giờ sáng, 12 giờ tối ở nhiệt ñộ 22 - 250C. Sau 7 ngày kiểm tra mẫu, soi hạt dưới kính lúp ñiện lần lượt từ vòng ngoài vào trong theo tâm ñĩa, ñối với những nấm chưa xác ñịnh rõ thì phải khều ñược bào tử nấm ñể soi dưới kính hiển vi, hoặc cho lên môi trường WA ñể làm thuần nấm, sau ñó chuyển sang môi trường PGA ñể quan sát tản nấm.
* Các chỉ tiêu theo dõi: TL bệnh, TL nảy mầm, TL hạt cứng, TL hạt thối.
3.3.2.5 Thử nghiệm một số dịch chiết thực vật trong việc ức chế nấm bệnh hại hạt giống lạc
* Dịch chiết tỏi
Phương pháp thu dịch chiết tỏi: tỏi bóc vỏ, ñem nghiền nhỏ, vắt lấy dịch, sau ñó pha loãng ra thành các nồng ñộ 5%, 10%, 15% và dùng ngay sau khi pha.
Ngâm hạt trong mỗi nồng ñộ dịch chiết ở các khoảng thời gian 5 phút, 10 phút và 15 phút, sau ñó chắt dịch chiết, thấm khô hạt bằng giấy thấm ñã
ñược hấp vô trùng. ðặt hạt trên giấy thấm ñược phun ẩm bằng nước cất vô trùng ñể trong hộp petri, mỗi hộp petri ñặt 10 hạt, sau 7 ngày kiểm tra theo phương pháp giám ñịnh bệnh hại hạt giống trên hạt.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………37
công thức, mỗi công thức là 30 hạt, nhắc lại 4 lần, thử nghiệm trên giống L14.
+ Thí nghiệm với dịch chiết tỏi 5%
CT1: ðối chứng (ngâm hạt trong nước cất).
CT2: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng ñộ 5% trong 5 phút. CT3: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng ñộ 5% trong 10 phút. CT4: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng ñộ 5% trong 15 phút.
+ Thí nghiệm với dịch chiết tỏi 10%
CT1: ðối chứng (ngâm hạt trong nước cất).
CT2: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng ñộ 10% trong 5 phút. CT3: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng ñộ 10% trong 10 phút. CT4: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng ñộ 10% trong 15 phút.
+ Thí nghiệm với dịch chiết tỏi 15%
CT1: ðối chứng (ngâm hạt trong nước cất).
CT2: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng ñộ 15% trong 5 phút. CT3: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng ñộ 15% trong 10 phút. CT4: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng ñộ 15% trong 15 phút. * Dịch chiết sả và dịch chiết gừng:
Phương pháp thu dịch chiết sả: Củ sả rửa sạch, cho vào máy nghiền nhỏ, vắt lấy dịch, sau ñó pha loãng thành các nồng ñộ 5%, 10%, 15% và dùng ngay sau khi pha.
Phương pháp thu dịch chiết gừng: Tương tự, củ gừng rửa sạch, cho vào máy nghiền nhỏ, vắt lấy dịch, sau ñó pha loãng thành các nồng ñộ 5%, 10%, 15% và dùng ngay sau khi pha.
Tiến hành thí nghiệm và bố trí các công thức tương tự nhưñối với dịch chiết tỏi.
Chỉ tiêu theo dõi: TL nảy mầm, TL mầm bình thường, TL mầm dị dạng và TL mầm và hạt nhiễm nấm.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………38