3. ðỐ IT ƯỢNG, ðỊ Að IỂM, NỘI DUNG VÀ PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3 Các phương pháp nhận biết sự hiện diện của gen chuyển vào
3.3.3.1 Phương pháp nhận biết qua môi trường chọn lọc
Mẫu ñược cấy trên môi trường chọn lọc có bổ sung PPT 2,5 ml/l. Sau nhiều lần cấy chuyển trên môi trường chọn lọc, nếu mẫu sống thì có gen chuyển vào.
3.3.3.2 Phương pháp nhận biết qua biểu hiện của gen chỉ thị gus
Phương pháp xác ñịnh sự biểu hiện tạm thời của gen gus (Jefferson, 1987):
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………46
1) Mẫu cấy ñược rửa sạnh vi khuẩn sau ñó ñược bỏ vào các ống effendoff hoặc vào giếng bản thử. Chú ý có mẫu ñối chứng âm.
2) Bổ sung X-Gluc ñến khi ngập mẫu 3) Phủ kín bản mẫu bằng giấy mầu
4) Ủ qua ñêm ở nhiệt ñộ 370C, ñiều kiện tối 5) Hút dịch nhuộm
6) Bổ sung dung dịch phá cấu trúc Chlorophyl II, lắc nhẹ, ngâm khoảng 15-60 phút. Có thể tiến hành nhiều lần ñến khi thấy mẫu có màu trắng (hết Chlorophyl II)
7) Soi mẫu dưới kính lúp ñể quan sát sự nhuộm màu gus:
- Nếu có sự chuyển gen và gen ñó ñược biểu hiện thì tại ví trí tế bào ñó sẽ có màu xanh chàm ñặc trưng. Màu xanh chàm có dạng các ñiểm, kích thước nhỏ.
- Nếu không có gen biểu hiện thì mẫu cấy sẽ không có màu xanh chàm.
3.3.3.3 Phương pháp tách chiết ADN
1. Nghiền lá bằng chày cối sứ: 0,1g lá + 350 Mm ADN extraction buffer 2. Thêm vào 350 ml ADN extraction buffer, trộn ñều, chuyển sang ống
mới + 10 ml ARNase + 2 ml β – mercaptoethanol
3. Trộn ñều, ủở 370C trong 1 giờ; khoảng 5 – 10 phút ñảo một lần
4. Thêm 700 ml dung dịch Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) trộn ñều và ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút
5. Chuyển dung dịch trên sang ống mới và tiếp tục lặp lại bước 5 và 6 6. Thêm 800 ml cồn 100% (ñể ADN kết tủa) rồi trộn ñều, ly tâm 3 – 5
phút (1300 vòng/phút trong 5 phút).
7. Rửa = cồn 700C 3 lần rồi phơi khô khoảng 30 phút 8. Hoà với TE rồi giữở - 200C
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………47 3.3.3.4 Phương pháp PCR - Quy trình chạy mồi p35S: ADN 2µl H20 ñề ion : 8,2µl Buffer 10X: 1,5µl Mg25uM: 1µm dNTP10µM : 0,3ml Primer F: 0.5µl, nồng ñộ 10µM Primer R: 0,5 µl, nồng ñộ 10µM taq Polymerase 1U; 1µl
Tổng thể tích phản ứng là 15µl.
- Cặp mồi ñặc hiệu Promoter 35S khuếch ñại 1 ñoạn nucleotide dài 190 bp nằm trong vùng ñiều hoà của gen.
- Chu trình chạy PCR như sau: Chu kỳ 1: 950C 5phút;
Chu kì 2: bước 1: 950C 40 giây
bước 2: 58- 600C trong 1 phút 30 giây bước 3: 720C trong 1 phút
Chu kì 2 lặp lại 35 lần Chu kỳ 3: 720C trong 5 phút
Chu kỳ 4: giữở nhiệt ñộ 40C.
- Chạy ñiện di : nồng ñộ agarose 1%, hiệu ñiện thế 200 vol, trong 15 - 20 phút. Quan sát và so sánh vạch xuất hiện trên bản ñiện di với nhau và với thang chuẩn 1000 bp.