3. ðỐ IT ƯỢNG, ðỊ Að IỂM, NỘI DUNG VÀ PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.3Nhóm thí nghiệm ñ ánh giá sản phẩm chuyển gen
3.2.3.1 Thí nghiệm 9
Xác ñịnh sâu bộ cánh vảy hại cây hoa ñồng tiền
Quy trình tiến hành như sau:
- Tìm hiểu ñặc ñiểm, hình thái các sâu thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera. - Thu bắt các sâu thuộc bộ cánh vảy trên ñồng ruộng.
- Cho mỗi sâu vào trong một hộp có ñục lỗ thở phía trên.
- Nuôi sâu bằng lá cây hoa ñồng tiền chưa chuyển gen trong 2 ngày. - Hàng ngày bổ sung thức ăn cho sâu, theo dõi, ghi chép và chụp ảnh. - Loại bỏ những sâu bị chết vì không ăn lá ñồng tiền.
- Giữ lại những sâu còn sống ñể tiếp tục làm thí nghiệm test kháng sâu.
3.2.3.2 Thí nghiệm 10
Test kháng sâu
Quy trình tiến hành như sau:
- Nuôi sâu thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera bằng lá cây ñồng tiền có kết quả PCR dương tính.
- Sâu ñối chứng ñược nuôi bằng lá của các cây ñồng tiền không ñược chuyển gen.
- Mỗi công thức nuôi 30 sâu, chia làm 3 lần nhắc lại.
- Hàng ngày bổ sung thức ăn, ghi chép, theo dõi hoạt ñộng, tình trạng sống chết, và chụp ảnh.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………41 Bảng 3.5. Test kháng sâu Tỷ lệ chết (%) Công thức Dòng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8 Ngày 9 Ngày 10 1 ðC 2 D1 3 D2 4 ... 3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp nuôi cấy mô
Mô nuôi cấy là các bộ phận khác nhau của cây: callus, ñoạn thân, lá... Mô ñược nuôi trên môi trường tái sinh và môi trường nhân ñể tạo chồi và nhân lên với số lượng lớn. Môi trường nuôi cấy ñược ñiều chỉnh ñộ pH = 5,8 trước khi tiệt trùng và ñược khử trùng ở 1210C, 1 atm, trong thời gian 20 phút. Mẫu ñược nuôi ở nhiệt ñộ 22 - 250C, cường ñộ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 h/ngày.
Các loại môi trường ñược sử dụng bao gồm:
o Môi trường nhân cây: MS + 30 g/l sucrose + 10 g/l gluco + 0,5 mg/l BA + 0,3 mg/l kinetin + 7 g/l agar, pH = 5,4.
o Môi trường tái sinh: MS + 30 g/l sucrose + 10 g/l gluco + 2 mg/l BA + 0,3 mg/l kinetin + 0,1 mg/l IAA + 100 mg/l inositol + 7 g/l agar, pH = 5,4.
o Môi trường LB lỏng: 10g tripton + 10g NaCl + 5g cao nấm men, pH = 7.
o Môi trường pha loãng vi khuẩn (môi trường ñồng nuôi cấy loãng): MS + 30 g/l sucrose + 10 g/l gluco + 10 mM/l MES + 2 mg/l BA +0,3 mg/l kinetin + 0,1 mg/l IAA + 100 mg inositol/l +1 g/l cassamino acid + 20 mg/l AS, pH = 5,4.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………42
o Môi trường ñồng nuôi cấy: MS + 30 g/l sucrose + 10 g/l gluco + 10 mM/l MES + 2 mg/l BA +0,3 mg/l kinetin + 0,1 mg/l IAA + 1 g/l cassamino acid + 100 mg/l inositol + 7 g/l agar + 20 mg/l AS, pH=5,4 (giống môi trường pha loãng vi khuẩn nhưng có thêm agar).
o Môi trường rửa khuẩn: MS + 500 mg/l cefotaxime.
o Môi trường diệt khuẩn: MS + 30 g/l sucrose + 10 g/l gluco + 2 mg/l BA + 0,3 mg/l kinetin + 0,1 mg/l IAA + 100 mg inositol/l + 7 g/l agar + 1 g/l cassamino acid + 500 mg/l cefotaxime, pH = 5,4 (giống môi trường tái sinh nhưng có thêm 500 mg/l cefotaxime).
o Môi trường chọn lọc: MS + 30 g/l sucrose + 10 g/l gluco + 2 mg/l BA + 0,3 mg/l kinetin + 0,1 mg/l IAA + 100 mg inositol/l + 7 g/l agar + 1 g/l cassamino acid + 500 mg/l cefotaxime + 2,5 ml/l PPT, pH = 5,4 (giống môi trường diệt khuẩn nhưng có thêm 2,5 ml/l PPT).
3.3.2 Các phương pháp chuyển gen
3.3.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
Vi khuẩn ñược lưu giữ trong tủ lạnh. Dùng panh cạo nhẹ một lớp khuẩn trên bề mặt rồi ñưa vào môi trường LB lỏng. ðặt bình có chứa khuẩn này vào máy lắc ở 280C trong 48 giờ với tốc ñộ 200 vòng/phút.
3.3.2.2 Phương pháp nhiễm mẫu với vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Có nhiều phương pháp lây nhiễm khác nhau. Tuy nhiên ở ñây chúng tôi thực hiện thí nghiệm với 3 phương pháp phổ biến hơn cả, ñó là:
- Ngâm: Mẫu cấy ñược ngâm vào dung dịch vi khuẩn trong thời gian từ 5 - 10 phút, vớt ra, ñể khô trên giấy thấm vô trùng, cấy mẫu vào môi trường
ñồng nuôi cấy.
- Nhỏ: Mẫu ñược cấy trên môi trường ñồng nuôi cấy, sau ñó dùng micropipet hút 10µl dung dịch vi khuẩn nhỏ vào mẫu.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………43
- Cắt: Mẫu có kích thước lớn ñược cắt trực tiếp trong dung dịch pha loãng vi khuẩn thành các ñoạn nhỏ 3 mm, sau ñó cấy vào môi trường ñồng nuôi cấy.
ðối chứng là các mẫu không ñược lây nhiễm với vi khuẩn.
3.3.2.3 Phương pháp rửa vi khuẩn
Sau thời gian ñồng nuôi cấy, mẫu ñược gắp ra bình. ðổ nước cất vô trùng vào bình, lắc ñể vi khuẩn tách ra khỏi mẫu, sau ñó gạn nước khuẩn ra ngoài. Lặp lại thao tác này 2-3 lần cho ñến khi nước trong. Tiếp tục thao tác rửa khuẩn như trên bằng nước ñường hoặc dung dịch MS có bổ sung 500ml/l chất kháng sinh cefotaxime ñể diệt vi khuẩn trên bề mặt mẫu. Có thể rửa lại lần sau cùng bằng nước cất ñể loại bỏ kháng sinh bám trên mẫu, tránh xót mẫu. Sau khi rửa sạch, mẫu ñược ñặt trên giấy thấm vô trùng cho khô trước khi cấy vào môi trường diệt khuẩn.
3.3.2.4 Phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Bước 1. Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị huyền phù vi khuẩn
Dịch vi khuẩn ñược ly tâm ñể lấy sinh khối tế bào vi khuẩn ở tốc ñộ
5000 vòng/phút trong 10 phút ở ñiều kiện nhiệt ñộ phòng và ñược pha trong môi trường pha loãng vi khuẩn.
Bước 2. Chuẩn bị mẫu cấy
Mẫu ñược cắt từ các bộ phận của cây sau ñó tiền nuôi cấy trên môi trường thích hợp.
Từ ñặc ñiểm hình thái và kinh nghiệm nuôi cấy in vitro cây hoa ñồng tiền, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 3 loại mô:
- Callus: kích thước 3 mm, ñược cắt từ phần gốc phát sinh từ thân ñồng tiền nuôi trong môi trường tái sinh 2 tuần.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………44
- ðoạn thân mang mắt ngủ: kích thước 1-2 mm, ñược cắt theo chiều ngang từ phần thân sát gốc, phần này mang các mắt ngủ, sau này sẽ phát triển thành các chồi mới.
- Lá: kích thước 5-10 mm, ñược cắt từ các lá bánh tẻ.
- ðối chứng: là 3 loại mô trên nhưng không ñược lây nhiễm với vi khuẩn.
Bước 3. Nhiễm mẫu với vi khuẩn (tiến hành chuyển gen)
Thực hiện thao tác theo một trong các phương pháp nhiễm mẫu với vi khuẩn (ñã nêu ở phần 3.3.2.2. Phương pháp nhiễm mẫu)
Bước 4. ðồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn
Mẫu ñược nuôi cấy trong tối, 22 - 240C trong một vài ngày.
Bước 5. Rửa khuẩn
Gắp mẫu ra khỏi môi trường ñồng nuôi cấy và rửa sạch vi khuẩn bằng nước cất và dung dịch rửa.
- Tráng: ñổ dung dịch rửa khuẩn vào bình có chứa mẫu sau ñó gạn nước ra
- Lắc 60 giây: ñổ dung dịch rửa khuẩn vào bình có chứa mẫu sau ñó cầm cổ bình lắc ñều trong 60 giây rồi gạn nước ra
- Lắc 30 giây: ñổ dung dịch rửa khuẩn vào bình có chứa mẫu sau ñó cầm cổ bình lắc ñều trong 30 giây rồi gạn nước ra (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lắc 5-10 giây: ñổ dung dịch rửa khuẩn vào bình có chứa mẫu sau ñó cầm cổ bình lắc ñều trong 5-10 giây rồi gạn nước ra
- ðối chứng là các mẫu không ñược lây nhiễm với vi khuẩn và rửa khuẩn mà cấy ngay trên môi trường diệt khuẩn.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………45
trường diệt khuẩn. Theo dõi tỷ lệ mẫu sống và ñộ sạch của mẫu sau 2 tuần.
Bước 6. Chuyển mẫu qua môi trường diệt khuẩn
Sau khi rửa sạch vi khuẩn, mẫu ñược ñể ráo nước trên giấy thấm vô trùng, sau ñó cấy vào môi trường diệt vi khuẩn. Mẫu ñược cấy chuyển ñịnh 2 tuần 1 lần sang môi trường diệt khuẩn mới. Lặp lại thao tác cấy chuyển trên môi trường diệt vi khuẩn trong 1-2 tháng ñể mẫu sạch vi khuẩn.
Bước 7. Chuyển mẫu qua môi trường chọn lọc
Mẫu ñược cấy chuyển ñịnh 2 tuần một lần sang môi trường chọn lọc. Lặp lại thao tác cấy chuyển trên môi trường chọn lọc trong 2-3 tháng.
Bước 8. Cảm ứng tạo rễ cho các chồi tái sinh
Mẫu ñược cấy chuyển sang môi trường cảm ứng tạo rễ.
Bước 9. Xác ñịnh ñược sự hiện diện của các gen cần chuyển vào Bước 10. Biotest
Cho mỗi sâu vào trong một hộp có ñục lỗ thở nhỏ phía trên. Nuôi sâu bằng lá cây ñồng tiền có kết quả PCR dương tính. Sâu ñối chứng vẫn ñược nuôi bằng lá của các cây ñồng tiền chưa chuyển gen. Ghi nhãn cho các hộp và phân loại theo các dòng ñồng tiền nêu trên. Mỗi công thức nuôi 30 sâu, chia làm 3 lần nhắc lại. Hàng ngày bổ sung 5 lá/hộp, ghi chép, theo dõi hoạt ñộng, tình trạng sống chết, và chụp ảnh. Tiến hành theo dõi trong 10 ngày.