2.5.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu về gen CHS ở cây hoa ñồng tiền
Chalcone synthase (CHS) là enzyme chủ yếu trong quá trình tổng hợp các sắc tố anthocyanin. Năm 1993, Y. Helariutta và cộng sự nghiên cứu sựña dạng của các gen giống CHS bằng cách phân tích cấu trúc, các kiểu biểu hiện và ñặc tính xúc tác của các enzyme tương ứng với ba gen này giải phóng ra trong quá trình phát triển hoa ñồng tiền lai. [23]
Năm 1993, P. Elomaa và cộng sự khẳng ñịnh phương pháp tái sinh và chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium cho cây hoa ñồng tiền lai, một cây hoa trang trí có giá trị thương mại quan trọng ñã và ñang ñược phát triển. Công trình của họ mang tên "Chuyển cDNA mang chalcone synthase ức chế sắc tố hoa vào cây hoa ñồng tiền gián tiếp thông qua vi khuẩn
Agrobacterium". Họ ñã tiến hành ñồng nuôi cấy các ñoạn cuống lá của giống
ñồng tiền ñỏ Terra Regina với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vectơ có mang một cDNA antisense mã hóa chalcone synthase ñồng tiền dưới sự ñiều khiển của CaMV 35S promoter và nos-nptII marker. Các mẫu chuyển gen
ñược chọn lọc trên môi trường kanamycin và ñược tái sinh thành cây hoàn chỉnh. cDNA antisense ñã ngăn cản sự tổng hợp anthocyanin và làm thay ñổi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………28
Năm 1995, P. Elomaa cùng cộng sự cũng ñã thành công trong việc chuyển 2 loại cDNA khác nhau gchs1 và gchs2 thuộc cùng một họ gen CHS dưới sựñiều khiển của CaMV 35S promoter vào cây hoa ñồng tiền. Việc kìm hãm sự biểu hiện gen sử dụng kỹ thuật antisense ñã thành công ở nhiều trường hợp. Tuy nhiên trong báo cáo này, họñưa ra một hình thức ức chế biểu hiện gen khác của các thành phần trên họ chalcone synthase (chs) của các cây hoa ñồng tiền chuyển gen. Họ ñã chuyển hai loại cDNAs khác nhau của họ
chs, ñó là gchs1 và gchs2, theo hướng antisense dưới sự ñiều khiển của CaMV 35S promoter vào cây hoa ñồng tiền. Rõ ràng gchs2 không liên quan
ñến việc tổng hợp anthocyanin và mã hõa một enzyme với ñặc tính xúc tác mới. Trong cả hai trương hợp, việc ngăn chặn hiệu quả sự biểu hiện gen resident sense ñã ñược xác ñịnh. Thêm vào ñó, việc chuyển gen tác ñộng khác nhau ñến sự biểu hiện của các thành phần khác của họ gen chalcone synthase. Mức ñộ của việc ngăn chặn phụ thuộc vào chuỗi tương ñồng giữa antisense và các gen ñích. Trong các trường hợp màu sắc kiểu hoa ở các mẫu chuyển gen anti- gchs1 thay ñổi trong quá trình phát triển, sự suy giảm ảnh hưởng của antisense bắt ñầu từ thành phần xa nhất của họ gen, xa hơn là ảnh hưởng của chuỗi tương ñồng ñối với sựổn ñịnh của việc ngăn chặn antisense. [20]
Nghiên cứu về gen DFR ở cây hoa ñồng tiền
Gen có vai trò trong việc hình tạo màu sắc của hoa là gen DFR (dihydroflavonol-4-reductase). Gen này tổng hợp ra enzyme DFR, một enzyme có vai trò trong quá trình tổng hợp sắc tố tạo màu cho hoa. Năm 1993, Y. Helariutta và cộng sự ñã nhân dòng cDNA mã hóa gen DFR và mô tả sự biểu hiện của DFR trong cánh hoa ñồng tiền giống lai Regina. Hai năm sau, họ tiếp tục phát hiện ra hoa ñồng tiền có sựñiều khiển ở nhiều mức ñộ tổ
chức khác nhau trên gen DFR trong quá trình nở hoa. Năm 1995, P. Elomaa và cộng sự ñã biến ñổi RL01 Petunia ñột biến với các cDNA A1 từ ngô và
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………29
gdfr từ ñồng tiền, cả hai ñều mã hóa DFR hoạt ñộng. Các thí nghiệm ñều sử
dụng cùng một loại vector Agrobacterium và CaMV 35S promoter. Kết quả
thu hai kiểu hình khác nhau rõ rệt. Hoa ñược chuyển gen A1 nhợt nhạt và màu sắc thay ñổi trong khi hoa ñược chuyển gen gdfr thì có màu rực rỡ và ổn
ñịnh trong quá trình phát triển. Tiếp theo, rất nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả về gen DFR trên cây hoa ñồng tiền ñã ra ñời như Paula Elomaa 1998, Stefan Martens 2002, Anne Uimari 2003...
Năm 1998, V. Nagarajiu, G.S.L.Srinivas và G.Lakshmi Sita nghiên cứu quy trình chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium cho cây hoa ñồng tiền có giá trị thương mại. Nguồn vật liệu là cuống lá, lá, chồi ñỉnh. ðồng nuôi cấy chúng với vi khuẩn Agrobacterium dòng LBA4404. Chủng vi khuẩn này mang vector ñôi gồm gen nptII và gen uidA. Môi trường tạo callus và tái sinh chồi: MS + BA + 1 mg/l kinetin + 0,5 mg/l NAA. Môi trường chọn lọc mẫu sau chuyển gen có bổ sung thêm 20 mg/l kanamycin thu ñược kết quả 0,44- 17% mẫu sống. Kết quả của chuyển gen nptII và uidA ñược khẳng ñịnh bởi phương pháp PCR và lai Southern Blot. Các chồi chuyển gen ñược nhân trên môi trường MS + 0,25 mg/l BA, ra rễ trên môi trường MS, và ñưa ra giá thể ñất thành công. Quy trình này có thể áp dụng ñể chuyển các gen quan trọng có thểñiều khiển ñược quá trình tổng hợp sắc tố hoa. [27]
Nghiên cứu về gen MADS-box ở cây hoa ñồng tiền
Sự nở hoa của họ cúc phát triển cụm hoa dạng ñầu với hàng nghìn hoa riêng biệt. Ở ñồng tiền, có ba loại hoa phân biệt trong cụm hoa dạng ñầu: hoa phía ngoài mép của cụm hoa ñầu, hoa chuyển tiếp ở giữa và hoa ở trung tâm
ñĩa hoa. Các hoa có nhiều hình thái thay ñổi theo giới tính và mức ñộ ñối xứng. ðể nghiên cứu cơ sở phân tử về mức ñộ phức tạp của hoa họ cúc, một số gen MADS-box ở ñồng tiền ñã ñược phân lập. Dựa trên phân tích hệ thống phát sinh loài và so sánh các gen MADS-box của Arabidopsis và
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………30
Antirrhinum, các gen phân lập ñược nhóm thành các gen ABC MADS-box. Tuy nhiên, phân tích sự biểu hiện phát hiện một số trong những gen này có thể có những chức năng khác. Chuyển gen ở cây hoa ñồng tiền sử dụng sense và antisense từ các cDNA ñược phân lập ñã mang lại nhiều thông tin bổ ích. Trước tiên, chúng ta có thể xác ñịnh mô hình ABC của sự phát triển hoa chủ
yếu ở bộ cúc. Thứ hai, nó chứng minh rằng các vai trò giả thiết của các gen phân lập như các gen chức năng ABC là ñúng. Thứ ba, và là quan trọng nhất, chuyển gen ñã phát hiện vai trò của các gen MADS-box mà ban ñầu chức năng của chúng bịẩn ñi. [22]
Năm 2001, P. Elomaa1 và T.H. Teeri ñã nghiên cứu hoa ñồng tiền chuyển gen. Công trình này khẳng ñịnh không chỉ cDNAs của ñồng tiền mà gen của các loài thực vật khác cũng ñã ñược chuyển thành công vào cây hoa
ñồng tiền. Việc sử dụng nhiều gen của ñường hướng flavonoid và các gen MADS-box có thể khử sắc tố hoa và thay ñổi ñặc ñiểm cấu trúc ở giống Terra Regina. Bên cạnh ñó các thông tin quan trọng của kỹ thuật antisense cũng ñã
ñạt ñược. Phương pháp antisense ở cây ñồng tiền có hiệu quả cao và có thể ñược ứng dụng ñể tạo ñột biến cho nhiều gen, do ñó cũng tạo ra các kiểu hình mới. Gần một nửa số gen chuyển ñột biến này ñã phát hiện có sự biểu hiện của gen mới bị khử. [23]
Năm 2008, Miia Marika Ainasoja và cộng sự ñã tiến hành so sánh các dòng ñồng tiền chuyển gen và các giống truyền thống. Kết luận không có sự
khác nhau về cytotoxicity hay trao ñổi chất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Như vậy, hiện có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen trên ñối tượng hoa ñồng tiền trên thế giới nhưng chủ yếu tập trung vào các gen làm thay ñổi màu sắc và làm cho hoa ñồng tiền trở nên ñẹp hơn, có giá trị thương mại cao hơn. Phương pháp chuyển gen sử dụng chủ yếu là gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………31
2.5.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây hoa ñồng tiền
Trước khi tiến hành chuyển gen, cần nghiên cứu hệ thống tái sinh làm cơ sở ñể tái sinh cây sau khi chọn lọc. Hiện ñã có một số công trình liên quan
ñược công bố bao gồm: Nghiên cứu quy trình nhân nhanh cây hoa ñồng tiền (Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị
Phương Hoa, 2002); Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống hoa ñồng tiền Nam Phi (Gerbera Jamesoll) (Trịnh Quốc Bình, 2005); Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống tái sinh cây hoa ñồng tiền và lily phục vụ tạo giống hoa mới bằng kỹ
thuật chuyển gen (Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, 2005); Nghiên cứu nhân giống vô tính cây hoa ñồng Tiền (Gerbera jamesonii) từ lát mỏng tế bào phát hoa (ðặng Lâm Trúc, 2005); Nghiên cứu sản xuất cây hoa
ñồng tiền (Gerbera jamesonii Bolus) bằng kỹ thuật nhân giống in vitro (Trần Tế, ðoàn Nhân Ái,Trương Thị Bích Phượng, 2008).
Nghiên cứu về chuyển gen ở cây hoa ñồng tiền
Theo "Kết quả bước ñầu chuyển gen vào cây hoa ðồng tiền Gerbera jamesonii “Ferrari” nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens" (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2006), một số các thông số trong quy trình chuyển gen cho cây ñồng tiền Ferrari nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefacien ñã
ñược xác ñịnh. Chất kháng sinh cefotaxime bổ sung vào môi trường nuôi cấy
ñể diệt vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ñược xác ñinh ở nồng ñộ 500 mg/lít. Nồng ñộ PPT dùng cho chọn lọc là 2,5 mg/lít cho callus và 3,0 ppm trở lên ñược dùng làm nồng ñộ cho chọn lọc các cây ñồng tiền ñó ñược chuyển gen kháng PPT trong ñiều kiện nuôi cấy in vitro. Môi trường ñồng nuôi cấy vi khuẩn và callus ñồng tiền là: MS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 2mg/l BA, 0,3mg/l kinetin, 0,1mg/l IAA, 1g/l cassamino acid, 20mg/l AS, 7,0 gram agar/lít, pH = 5,4. Sau chọn lọc 3 lần, ñã có sự biểu hiện của gen gus
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………32
trong callus ñồng tiền Ferrari. Trên môi trường có bổ sung PPT ở nồng ñộ 3,0 mg/lít, ñã tái sinh ñược 2 cây ñồng tiền sau chọn lọc. Kết quảñiện di sau khi nhân ñoạn gen nos cho phép khẳng ñịnh ñã thu ñược hai cây ñồng tiền chuyển gen. [13]
Phạm Thị Dung (2008), trong Báo cáo tốt nghiệp về "Nghiên cứu chuyển gen cho hoa ñồng tiền nhờ vi khuẩn ñất Agrobacterium tumefaciens" ñã khẳng ñịnh: Thời gian ñồng nuôi cấy thích hợp nhất cho chủng khuẩn
Agrobacterium tumerfaciens AA16 mang gen gfp là 2 ngày trong ñiều kiện 280C, bóng tối; nguồn mẫu thích hợp ñưa vào ñồng nuôi cấy là ñoạn thân mang mắt ngủ; phương pháp cắt mẫu trên giấy thấm vô trùng sau ñó lây nhiễm trong dịch vi khuẩn ñạt hiệu quả chuyển gen tốt nhất; tiền nuôi cấy 5 ngày là khoảng thời gian thích hợp nhất trước khi tiến hành lây nhiễm với vi khuẩn; phương thức lây nhiễm với dịch vi khuẩn pha loãng sau ñó ñồng nuôi cấy trên môi trường ñồng nuôi cấy; kiểm tra biểu hiện của gen gfp trong mẫu ở giai ñoạn callus và cây tái sinh có xuất hiện gen trong callus, lá, rễ.[5]
Một số công trình nghiên cứu chuyển gen khác cũng ñược tiến hành trên ñối tượng cây hoa ñồng tiền là: Nghiên cứu xác ñịnh một số yếu tố trong quy trình chuyển gen cho cây lily và cây ñồng tiền thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2006); Nghiên cứu hệ thống tái sinh và bước ñầu chuyển gen trên cây ñồng tiền nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens (Trần Ngọc Tuân, 2006).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………33
3. ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU