3. ðỐ IT ƯỢNG, ðỊ Að IỂM, NỘI DUNG VÀ PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Nhóm thí nghiệm xác ñị nh các thông số cho quá trình chuyển gen
Trong vòng 1 tuần trước khi tiến hành chuyển gen, các thí nghiệm ñều phải chuẩn bị các phần sau:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………36
- Chuẩn bị mẫu cấy (tiền nuôi cấy): cắt mô của cây hoa ñồng tiền in vitro thành các ñoạn nhỏ rồi ñặt trên môi trường tái sinh. Các chồi còn lại ñược ñặt trên môi trường nhân ñể tiếp tục tạo mẫu cho các thí nghiệm sau.
- Chuẩn bị dụng cụ: Giấy sạch ñể cắt mẫu, ñĩa petri ñể ñựng môi trường
ñồng nuôi cấy và giấy thấm vô trùng, ống li tâm ñể li tâm vi khuẩn, bình không ñể ñựng mẫu khi lây nhiễm, giấy thấm vô trùng, ống ñong 10 ml ñểñong As bổ sung vào môi trường pha loãng vi khuẩn và ñồng nuôi cấy sau khi hấp. Tất cả các dụng cụ chuyển gen ñều ñược hấp vô trùng trước khi sử dụng.
- Chuẩn bị môi trường: môi trường LB lỏng, môi trường pha loãng vi khuẩn, môi trường ñồng nuôi cấy.
- Chuẩn bị vi khuẩn: Lấy 50 ml dung dịch LB lỏng cho vào bình trụ. Dùng panh lấy 2 gợt vi khuẩn từñĩa petri chứa vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (ñể
trong tủ lạnh) nhúng vào dung dịch LB. ðậy nắp bạc rồi ñặt vào máy lắc trong vòng 12-24 giờ tùy thuộc vào nhiệt ñộ.
Các thao tác chuyển gen ñược tiến hành theo trình tự sau:
o Lấy dung dịch ñựng vi khuẩn ñã lắc từ ngày hôm trước cho vào 2 ống li tâm
o ðặt 2 ống li tâm ở vị trí ñối xứng nhau vào máy li tâm, cài ñặt chếñộñể máy chạy với tốc ñộ 5000 vòng/phút trong 10 phút
o Mang 2 ống li tâm trở lại box cấy ñể gạn bỏ nước, khối màu hồng vàng ở ñáy ống là sinh khối vi khuẩn
o ðổ 100 ml dung dịch pha loãng vi khuẩn vào bình trụ, ñổñầy 2 ống li tâm bằng dung dịch này
o Lắc tan vi khuẩn ở ñáy ống vào trong dung dịch pha loãng vi khuẩn bằng máy Vontech
o ðổ dung dịch vi khuẩn ñã lắc trở lại bình trụ và lắc ñều, thu ñược dung dịch vi khuẩn pha loãng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………37
o Tiến hành lây nhiễm mẫu với vi khuẩn bằng cách ngâm với dung dịch vi khuẩn, cắt mẫu trong dung dịch hoặc nhỏ giọt dung dịch khuẩn lên mẫu
o Gắp giấy thấm vô trùng trong lọ ra ñặt trên ñĩa petri
o Gạn nước ra và gắp mẫu ñể trên giấy thấm vô trùng
o Gắp mẫu vào ñĩa petri chứa môi trường ñồng nuôi cấy
o Dán parafin, ghi nhãn, cho vào hộp giấy, ñể chỗ tối một vài ngày
o Mẫu ñối chứng ñược cấy ngay vào môi trường ñồng nuôi cấy không lây nhiễm với vi khuẩn
3.2.1.1 Thí nghiệm 1
Xác ñịnh mô thích hợp cho chuyển gen
Sử dụng 3 phần khác nhau của cây hoa ñồng tiền in vitro ñể chuyển gen: callus, ñoạn thân mang mắt ngủ và lá. Mục ñích là tìm ra loại mô có khả
năng nhận gen mục tiêu từ vi khuẩn có hiệu quả cao nhất. Các thí nghiệm sau sẽ sử dụng kết quả của thí nghiệm này ñể tiến hành chuyển gen. Công thức
ñối chứng gồm cả 3 loại mô trên nhưng không ñược lây nhiễm với vi khuẩn.
Bảng 3.1. Xác ñịnh mô thích hợp cho chuyển gen
Công thức Mô 1 ðối chứng 2 Callus 3 ðoạn thân mang mắt ngủ 4 Lá 3.2.1.2 Thí nghiệm 2 Xác ñịnh thời gian ñồng nuôi cấy thích hợp
Tiến hành nuôi cấy ñồng thời vi khuẩn và mẫu cấy trong cùng một môi trường trong các khoảng thời gian khác nhau: 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày
ñể tìm ra khoảng thời gian thích hợp nhất cho gen biến nạp từ vi khuẩn vào mẫu cấy. Công thức ñối chứng là mẫu cấy ñược cấy vào môi trường ñồng nuôi cấy nhưng không có vi khuẩn.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………38
Bảng 3.2. Xác ñịnh thời gian ñồng nuôi cấy thích hợp
Công thức Thời gian ñồng nuôi cấy (ngày)
1 ðối chứng 2 2 3 3 4 4 5 5 3.2.1.3. Thí nghiệm 3 Xác ñịnh thời gian tiền nuôi cấy thích hợp
Trước khi lây nhiễm với vi khuẩn, mẫu ñược cắt từ các bộ phận của cây và nuôi cấy khởi ñộng trong môi trường tái sinh. Thời gian tiền nuôi cấy này có
ảnh hưởng ñến việc làm lành vết thương và tạo callus của mẫu. Tiến hành tiền nuôi cấy trong thời gian: 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày. ðối chứng là mẫu ñược nuôi khởi ñộng ở các ngày trên nhưng không lây nhiễm với vi khuẩn. Mỗi công thức cách nhau 1 ngày nhằm tìm ra thời gian thích hợp nhất.
Bảng 3.3. Xác ñịnh thời gian tiền nuôi cấy thích hợp
Công thức Thời gian tiền nuôi cấy (ngày)
1 ðối chứng 2 1 3 3 4 5 5 7 6 9 3.2.1.4 Thí nghiệm 4
Xác ñịnh kỹ thuật lây nhiễm thích hợp
Bảng 3.4. Xác ñịnh kỹ thuật lây nhiễm thích hợp
Công thức Kỹ thuật lây nhiễm
1 ðối chứng
2 Ngâm mẫu vào dung dịch vi khuẩn (5-10 phút) 3 Nhỏ dịch vi khuẩn vào mẫu cấy
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………39
3.2.1.5 Thí nghiệm 5
Xác ñịnh kỹ thuật rửa khuẩn thích hợp
Bảng 3.5. Xác ñịnh kỹ thuật rửa khuẩn thích hợp
Công thức Kỹ thuật rửa khuẩn
1 ðối chứng
2 Tráng
3 Lắc 60 giây
4 Lắc 30 giây
5 Lắc 5-10 giây