pháp PCR
Phương pháp PCR đã được sử dụng rộng rãi để phát hiện hay phân biệt DNA của các sinh vật khác nhau từ nhiều nguồn mẫu.
Năm 1997, Wayne và ctv đã có công trình nghiên cứu về trình tự DNA ty thể
dài 2001bp của 23 dòng chó. Kết quả nghiên cứu cho thấy trên DNA ty thể có trình tự
bảo toàn cho cả 23 dòng chó.
Tại Hoa Kỳ, Sawyer (1997) đã tìm ra một phương pháp nhanh và nhạy để xác
định và ngăn chặn tình trạng nhập khẩu bò nhiễm BSE. Tác giảđã xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt bò trong thịt và bột xương thịt dựa trên đoạn gen bảo toàn của DNA ty thể bò.
Năm 1999, Matsunaga và ctv đã công bố công trình nghiên cứu phát hiện 6 loại thịt (bò, heo, cừu, dê, ngựa, gà) từ thịt chế biến. Tác giả sử dụng 7 đoạn primer với tỉ lệ thích hợp để phát hiện DNA chuyên biệt cho từng loài. Primer xuôi được thiết kế dựa trên trình tự DNA bảo toàn của DNA ty thể, còn primer ngược được thiết
kế dựa vào trình tự chuyên biệt ở mỗi loài. Các cặp primer này cho ra các sản phẩm PCR có kích thước khác nhau tương ứng với 6 loại thịt. Các đoạn DNA của dê, gà, bò, cừu, heo, ngựa lần lượt có kích thước: 157bp, 227bp, 274bp, 331bp, 398bp, 439bp. Kết quả PCR được quan sát bằng điện di. DNA của dê, bò, cừu, heo, được phát hiện cả đối với DNA tách chiết từ thịt xử lý nhiệt ở 100oC hay 120oC, riêng đối với thịt ngựa thì không phát hiện được ở 120oC. Giới hạn thấp nhất của nồng độ DNA mà phản ứng PCR còn phát hiện được là 0,25 ng.
Năm 2000, Montiel-Sosa và ctv thiết kế cặp primer có tính chuyên biệt cao trên
đoạn bảo toàn của gen DNA ty thể. Cặp primer này được dùng để khuếch đại đoạn DNA dài 531bp của gia cầm bằng phương pháp PCR. Phương pháp này tỏ ra hữu dụng cả thịt tươi và hỗn hợp thịt chế biến bao gồm thịt phơi khô và thịt nấu chín từ bò, cừu, gà.
Một phương pháp để phát hiện những trình tự DNA ty thể của thịt bò, thịt cừu, thịt heo, thịt gà dựa vào PCR đã được phát triển. Phương pháp cho phép phát hiện trong hỗn hợp có 0,01% loài mục tiêu (Kremar & Rencova, 2003).
Dalmasso & ctv (2004) đã sử dụng phương pháp multiplex PCR để phát hiện nguồn gốc loài của thịt làm nguyên liệu trong sản xuất thức ăn gia súc (thú nhai lại, gia cầm, cá, heo). Primer được thiết kế dựa vào các vùng khác nhau của DNA ty thể
(12S rRNA, tRNA và 16S rRNA) sau khi sắp gióng cột với các trình tự có sẵn trên ngân hàng gen. Giới hạn phát hiện là 0,004% cho primer cá, 0,002% cho primer thú nhai lại, gia cầm và heo.
Năm 2004, Miguel và ctv đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu, dê trong thịt tươi và thịt chế biến. Primer forward chung được thiết kế dựa vào trình tự DNA bảo tồn trên gene RNA ribosome 12S ty thể, reverse primer được thiết kế dựa vào trình DNA chuyên biệt mỗi loài. Kích thước khác nhau của các sản phẩm khuếch đại chuyên biệt ở mỗi loài được phân tách bằng phương pháp điện di. Giới hạn phát hiện của phương pháp này là 1% cho mỗi loài. Phương pháp này có thể
xác định chính xác những loài heo, bò, cừu, dê; có ích trong việc kiểm tra các sản phẩm thịt hỗn hợp, tránh tình trạng giả mạo hoặc không đúng nhưđã ghi trên nhãn.
Việc xác định nhanh thịt bò có trong thực phẩm là cần thiết để kiểm soát hiệu quả mầm bệnh bò điên. Năm 2004, Hong và ctv đã sử dụng phương pháp multiplex
PCR để phát hiện trình tự DNA chuyên biệt của thịt bò trong thực phẩm. Đồng thời tác giả cũng sử dụng phương pháp multiplex PCR để đánh giá chất lượng của mẫu kiểm nghiệm nhờ vào việc khuếch đại vùng DNA trên gene ribosome 18 S chuyên biệt ở bò. Sản phẩm khuếch đại là đoạn DNA của lactoferrin. Tác giả dựa vào sự khác nhau ở trình tự ty thể chuyên biệt để xác định thịt bò. Độ đặc hiệu của phương pháp này được xác nhận dựa vào sự vắng mặt của sản phẩm PCR tương đồng có thể phát hiện sử dụng những mẫu thực phẩm liên quan mà không có thịt và bột xương bò, hoặc những mẫu DNA từ động vật có xương sống mà những thứ bỏ đi của chúng thường có trong thức ăn chăn nuôi. Phương pháp này có thể phát hiện sự hiện diện của thịt bò trong thực phẩm khi những mẫu thực phẩm này chứa > 0,02 % thịt và bột xương bò. Hơn nữa, phương pháp này ít ảnh hưởng bởi việc xử lý nhiệt kéo dài. Độ đặc hiệu, thuận tiện và nhạy của phương pháp này cho thấy rằng nó có thể được sử
dụng để phát hiện thịt bò.
Arslan & ctv (2006) đã nghiên cứu ảnh hưởng của cách chế biến thịt đối với việc phát hiện thịt bò đã qua xử lý nhiệt bằng kỹ thuật PCR. Nhóm tác giả đã xử lý thịt bằng cách luộc ở 97,5oC trong 140 phút, 200 phút, 230 phút; quay ở 200oC trong 80 phút, 120 phút, 150 phút hoặc hấp khử trùng ở 120oC trong 30 phút, 60 phút, 90 phút; rán ở 115oC trong 45 phút, sau đó rán thêm cho đến khi không còn mùi thơm của thịt. Sản phẩm khuếch đại là 271 bp của DNA ty thể. Kết quả cho thấy rằng ngoại trừ mẫu thịt bò rán ở 80 phút, thịt bò được phát hiện trong tất cả các mẫu còn lại. Trịnh Thị Thanh Huyền và ctv (2007) cũng đã sử dụng phương pháp multiplex – PCR để phân biệt thịt cừu, heo, bò. Nghiên cứu đã xác định được quy trình thích hợp, trong đó lượng FSIM: RP: RBC: RS lần lượt là 12: 25: 7: 5 pmol, nhiệt độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính ở 94oC/1 phút, bắt cặp ở 54oC/ 45 giây, kéo dài ở 72oC/ 1phút. Nồng độ thấp nhất của thịt cừu, bò mà phản ứng multiplex-PCR có thể phát hiện là 1 ng/μl.
Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành
Đề tài được thực hiện từ 10/2010 đến 5/2011
Việc ly trích DNA và thực hiện PCR được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trường – Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3.2 Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt trâu và bò sử dụng primer tự thiết kế 3.2.1.1 Thiết kế và kiểm tra độđặc hiệu của primer phát hiện thịt trâu và thịt bò 3.2.1.2 Xác định quy trình PCR-trâu phát hiện thịt trâu
3.2.1.3 Xác định quy trình PCR-bò phát hiện thịt bò 3.2.2 Ứng dụng quy trình PCR- trâu, PCR- bò
Khảo sát quy trình PCR- trâu, PCR- bò trong việc phát hiện 2 loại thịt trâu và bò trong hỗn hợp DNA từ thịt tươi, thịt chế biến và bột thịt.
3.3 Vật liệu
3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA
Hai nhóm mẫu được dùng trong đề tài này là:
- Mẫu cơ vân các loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu được lấy tại lò mổở Củ Chi, TP HCM
- Mẫu bột xương thịt sử dụng trong chế biến thức ăn gia súc của các hãng sản xuất thức ăn gia súc.
3.3.2 Primer
- Primer tự thiết kế dùng trong kỹ thuật PCR để phát hiện thịt trâu, bò (PCR-trâu, PCR-bò).
- Cách thực hiện việc thiết kếđược trình bày ở phần phương pháp tiến hành. Trình tự của primer này được trình bày rõ ở phần kết quả.
3.3.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
Hóa chất tách chiết DNA: Tris HCl, NaCl, SDS, EDTA, protein K, sodium acetate,
isoamyl alcohol, phenol, chloroform, ethanol, TE 1X.
đệm 10X (Promega), dNTP 25mM (Promega), MgCl2 25 mM (Promega), các primer (IDT), nước cất 2 lần (khử ion, hấp vô trùng, chiếu UV, pH 6,8 – 7).
Hóa chất điện di: Agarose, TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH 8,3), loading dye 6X,
ladder 100bp, 200bp, ethidium bromide.
Thiết bị và dụng cụ: Tủ sấy (Jencons – PLS), water bath (Memmert), autoclave (Tommy), máy cất nước (khử ion) (Branstead), máy ly tâm (Mikro Z2K/Sigma 3K30C), tủ trữ mẫu và hóa chất (Reetech, Brandt, Sanyo), máy nghiền mẫu (Model A11, IKA-Đức), máy chụp gel (Biorad), máy luân nhiệt, bộ điện di (Biorad), máy đo OD (Hewlett Packard), micropipet, đầu tip, eppendorf, kéo, chày, kẹp...
3.4 Phương pháp tiến hành 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu
Mỗi loại thịt được lấy khoảng 500g cho vào từng túi nilon sạch kích thước 5 x 10 cm, dán nhãn cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thí nghiệm, trữở
-700C.
Mẫu bột xương thịt được lấy khoảng 6 mẫu (100g/mẫu) từ các công ty chế
biến thức ăn gia súc.
3.4.2 Tách chiết DNA
Sau khi rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng, việc tách chiết DNA được thực hiện theo dẫn liệu của Lương Quý Phương (2006). Cho khoảng 0,1g mẫu vào eppendorf 1,5 ml, dùng chày nghiền nhuyễn mẫu; cho vào 60 μl dung dịch đệm tách chiết (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA và 1% SDS, pH 8) và 3 μl dung dịch protease K (20 mg/ml); hỗn hợp được ủ ở 55oC trong 1 giờ. Sau đó, thêm vào hỗn hợp 375μl nước cất khử ion vô trùng, vortex 30 giây. Cho vào hỗn hợp 200 μl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); vortex trong 1 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 100C. Lấy phần nước nổi bên trên chuyển vào eppendorf mới đã có sẵn 1ml dung dịch cồn tuyệt đối; trộn đều; ủ -20oC trong 1 giờ. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC; phần cặn được đểở nhiệt độ phòng cho
đến khi khô hoàn toàn. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70%. Sau khi làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC, cho vào ống 200 μl dung dịch TE và ủ 55oC trong 2 giờ để làm tan cặn. Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được trữở - 20oC hoặc sử dụng ngay.
Độ tinh sạch DNA được kiểm tra bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Các
mẫu DNA được tách chiết có tỷ số OD260nm/OD280nm > 1,6 được sử dụng cho PCR. Hàm lượng DNA được ước lượng theo công thức:
DNA (ng/μl) = [62,9*OD260nm – 36*OD280nm]*độ pha loãng
3.4.3 Thiết kế và kiểm tra primer phát hiện thịt trâu và thịt bò
Với mục tiêu phân biệt thịt có nguồn gốc từ bò và trâu, các cặp primer dùng để
phát hiện thịt trâu và thịt bò được thiết kế dựa vào những vùng giống và khác nhau của gen cytochrome b, kiểm tra bằng FASTPCR, sau đó sắp gióng cột với những trình tự có sẵn trên ngân hàng gen bằng BLAST.
3.4.3.1 Thiết kế primer
Các cặp primer dùng phát hiện riêng biệt thịt bò và trâu đã được thiết kế theo các bước sau:
- Tìm trình tự gen cytochrome b của heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
- Sắp gióng cột các trình tự cytochrome b của mỗi loài bằng cách sử dụng ClustalW online (http://align.genome.jp) nhằm xem xét sự tương đồng ở mỗi loài. - Lấy đại diện mỗi loài heo, gà, dê, cừu, bò một trình tự gen cytochrome b để kiểm
tra sự tương đồng với forward primer (FSIM) bằng ClustalW.
- Lấy đại diện trình tự gen cytochrome b của mỗi loài heo, gà, dê, cừu, bò để kiểm tra sự tương đồng với từng reverse primer của Matsunaga và ctv (1998).
- Sử dụng trình tự cytochrome b trâu có mã số D82894 và bò có mã số AY885304
để thiết kế forward primer chung cho bò và trâu (dựa vào vùng tương đồng của gen cytochrome b bò và trâu nhưng không tương đồng với các loài khác như heo, gà, dê, cừu), reverse primer trâu và reverse primer bò (dựa vào vùng không tương
đồng của gen cytochrome b bò, trâu và các loài khác). Dự định sẽ thiết kế 2 forward primer chung cho bò và trâu (F1, F2), 2 reverse primer trâu (RBU1, RBU2), 2 reverse primer bò (RC1, RC2)
- Kiểm tra và lựa chọn các primer vừa thiết kế trên lý thuyết: kiểm tra sự bắt cặp giữa các primer, sự tương đồng của primer với các loài bằng FASTPCR, BLAST. - Trình tự các primer F, RBU và RC đã thiết kế được tổng hợp bởi công ty
Integrated Device Technology (IDT), Mỹ.
3.4.3.2 Kiểm tra và lựa chọn các primer vừa thiết kế trên lý thuyết
được thực hiện nhờ FASTPCR, BLAST. ¾ Kiểm tra bằng FASTPCR
FASTPCR là phần mềm thiết kế primer và kiểm tra primer. Các primer trong nghiên cứu này được thiết kế thủ công và kiểm tra lại bằng FASTPCR ở các thông số
như: chiều dài, Tm, %CG, Q (primer quality), primer dimer… ¾ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Trình tự primer thiết kếđược BLAST lên NCBI để kiểm tra mức độ tương đồng với trình tự của trâu và bò trên ngân hàng gen của NCBI.
3.4.3.3 Kiểm tra trên thực tếđộđặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC
Bằng PCR
Thực hiện phản ứng PCR từng cặp F & RB; F & RC với từng loại DNA template khác nhau của thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu; hỗn hợp DNA template trâu và bò; hỗn hợp DNA template gồm DNA thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu. Thành phần hóa chất phản ứng PCR kiểm tra độđặc hiệu primer theo bảng 3.1
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất phản ứng PCR kiểm tra độđặc hiệu primer Tên hóa chất Nồng độ cuối Dung dịch đệm PCR 1X MgCl2 2 mM F 10 pmol R(*) 10 pmol dNTP 200 μM/mỗi loại Taq 1 UI DNA mỗi loại 100 ng/1 phản ứng H2O cất Vừa đủ 30μl (*) RB/RC
Chu trình nhiệt sẽ phụ thuộc vào Tm của các primer và kích thước của sản phẩm cần khuếch đại.
Như vậy, cặp F – RB, F – RC đặc hiệu được chọn.
Cặp F-RB, F-RC đặc hiệu được kiểm tra bằng phương pháp PCR với các DNA template khác như lúa, đậu nành, đậu phộng, mè, cà chua, bắp... để khẳng định lại độ đặc hiệu của chúng.
Sản phẩm PCR của cặp F&RB, F&RC được gởi đến công ty Macrogene, Hàn Quốc giải trình tự.
Xác nhận sản phẩm khuếch đại
Kết quả giải trình tựđược BLAST lên NCBI để khẳng định lại chính xác sản phẩm khuếch đại là của trâu và của bò nhờ vào mức độ tương đồng cao với nhiều trình tự của trâu và bò trên ngân hàng gen của NCBI.
Cuối cùng, các chuỗi DNA thu được được gửi NCBI đểđăng ký mã số.
3.4.4 Xác định quy trình PCR- trâu và PCR-bò
Quy trình PCR-trâu, PCR-bò thích hợp là quy trình PCR-trâu, PCR-bò có primer đặc hiệu nhất trong việc phát hiện thịt trâu, thịt bò. Thành phần phản ứng, quy trình nhiệt cũng như cặp primer đặc hiệu cho PCR-trâu, PCR-bò như đã được xác
định trong thí nghiệm kiểm tra trên thực tếđộđặc hiệu các cặp primer ở mục 3.4.3.3.
3.4.5 Ứng dụng PCR-trâu, PCR-bò để phát hiện thịt trâu, bò
Các quy trình PCR-trâu, PCR-bò vừa được xây dựng ở mục 3.4.4 được dùng để
phát hiện thịt trâu và bò trong các loại mẫu thử nghiệm khác nhau: - Các hỗn hợp DNA và xác định giới hạn phát hiện
- Hỗn hợp thịt chế biến có xử lý nhiệt và không xử lý nhiệt. - Mẫu bột thịt
3.4.5.1 Ứng dụng PCR-trâu
a. Xác định giới hạn phát hiện của PCR-trâu
Nhằm xác định nồng độ DNA trâu thấp nhất mà PCR-trâu còn phát hiện được. Thực hiện PCR-trâu với DNA template là 12 nồng độ (bắt đầu với nồng độ 10ng/μl, nồng độ sau giảm 10 lần so với nồng độ trước, nghĩa là từ 101 ng/μl xuống 10-10 ng/μl)
b. PCR-trâu với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu
Mục tiêu của thí nghiệm là để tạo cơ sở cho việc phát hiện thịt trâu của PCR- trâu trong các hỗn hợp DNA khác nhau của nhiều loài và xác định ở nồng độ nào của DNA trâu mà PCR-trâu còn phát hiện được. Thí nghiệm thực hiện với DNA template
được phối trộn theo bảng 3.2
Lý do phối trộn với tỷ lệ theo bảng 3.5 như sau: Nguyên liệu để sản xuất bột thịt trong thức ăn gia súc chủ yếu là phế phẩm từ các lò mổ gia súc, gia cầm. Trong đó, phế phẩm của heo và gà là chủ yếu. Nên đề tài phối trộn tỷ lệ heo và gà bằng nhau và