Thí nghiệm này tiến hành với các hỗn hợp thịt chế biến xử lý nhiệt theo bảng 3.3
e. PCR-trâu với bột thịt trên thị trường
Bảng 3.3: Hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt
Kí hiệu hỗn hợp thịt chế biến xử lý nhiệt TT Tỷ lệ thịt heo, gà, trâu, bò, dê,
cừu trong các hỗn hợp Kí hiệu hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt 80oC/ 15’ 120oC/ 15’ 120oC/ 30’ 130oC/ 15’ 130oC/ 30’ 180oC/ 15’ 1 30:30:10:10:10:10 N1 M2.1 M3.1 M4.1 M5.1 M6.1 M7.1 2 40:40:5:5:5:5 N2 M2.2 M3.2 M4.2 M5.2 M6.2 M7.2 3 48:48:1:1:1:1 N3 M2.3 M3.3 M4.3 M5.3 M6.3 M7.3 4 49:49:0,5:0,5:0,5:0,5 N4 M2.4 M3.4 M4.4 M5.4 M6.4 M7.4 5 49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1 N5 M2.5 M3.5 M4.5 M5.5 M6.5 M7.5 6 49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05 N6 M2.6 M3.6 M4.6 M5.6 M6.6 M7.6 7 49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03 N7 M2.7 M3.7 M4.7 M5.7 M6.7 M7.7
3.4.5.2 Ứng dụng PCR-bò
a. Xác định giới hạn phát hiện của PCR-bò
Nhằm xác định nồng độ DNA bò thấp nhất mà PCR-bò còn phát hiện được. Thực hiện PCR-bò với DNA template là 12 nồng độ (bắt đầu với nồng độ 10ng/μl, nồng độ
sau giảm 10 lần so với nồng độ trước, nghĩa là từ 101 ng/μl xuống 10-10 ng/μl)
b. PCR-bò với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu
Mục tiêu của thí nghiệm là để tạo cơ sở cho việc phát hiện thịt bò của PCR-bò trong các hỗn hợp DNA khác nhau của nhiều loài và xác định ở nồng độ nào của DNA bò mà PCR-bò còn phát hiện được. Thí nghiệm thực hiện với DNA template được phối trộn theo bảng 3.2.
c. PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt
Nhằm tạo cơ sở cho việc xác định mức độ biến tính của thịt bò trong hỗn hợp thịt xử lý nhiệt, trước tiên tiến hành phát hiện thịt bò trong hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt. Thí nghiệm này tiến hành với các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt theo bảng 3.3.
d. PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt
Thí nghiệm này tiến hành với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt theo bảng 3.3.
e. PCR-bò với bột thịt trên thị trường
Sơđồ 3.1: Sơđồ nghiên cứu PCR-trâu, PCR-bò Xử lý nhiệt Không xử lý nhiệt Hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu - Chuẩn bị mẫu: Thịt tươi, thịt chế biến, bột thịt - Ly trích DNA Xây dựng quy trình PCR-trâu, PCR-bò
Ứng dụng quy trình PCR-trâu, PCR-bò đối với hỗn hợp DNA từ:
Thịt tươi Thịt chế biến Bột thịt
Chương 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả thiết kế và tổng hợp primer phát hiện thịt trâu, thịt bò
Kết quả sắp gióng cột các trình tự cytochrome b của trâu, bò lấy trên ngân hàng gen cho thấy tương đồng ở mỗi loài. Vì thế, tác giả lấy đại diện mỗi loài trâu, bò một trình tự cytochrome b để thiết kế primer:
¾ Cytochrome b trâu: D82894 (1140bp) ¾ Cytochrome b bò: AY885304 (1140bp)
Để tiết kiệm kinh phí, tác giả thiết kế foward primer chung cho cả trâu và bò (dựa vào vùng tương đồng cao của trâu và bò). Còn các reverse primer thì riêng biệt cho từng loài (dựa vào vùng không tương đồng của trâu và bò và với các loài khác). Tác giảđã thiết kế và gởi sang công ty IDT để tổng hợp 2 forward primer chung (F1, F2), 2 reverse primer trâu (RBU1, RBU2), 2 reverse primer bò (RC1, RC2) như bảng 4.1.
Bảng 4.1: Các primer thiết kế TT Tên Trình tự (5’-> 3’) Chiều dài Vị trí 1 F1 AGCCACAGCATTTATAGGATACGT 24 372 - 395 2 F2 CTACACATCCGACACAACAACAGC 24 162 -185 3 RBU1 GCGTATGCGAATAGGAAGTACCATTCA 27 810 - 836 4 RBU2 ATGTAGCAGGGGCATGAGAA 20 905 - 924 5 RC1 CTCAGATTCATTCGACTAAATTTGTGCCG 29 468 - 496 6 RC2 TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC 22 979 - 1000
4.2 Kết quả kiểm tra lý thuyết độđặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC 4.2.1 Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR 4.2.1 Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR
Kết quảở bảng 4.2 cho thấy tất cả các primer được thiết kếđều có Q > 80. Tm của các forward và reverse primer chênh lệch nhau không quá 3oC.
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR Primer Length Tm(oC) CG% Q F1 24 55,6 41,7 95 F2 24 58,2 50 104 RC1 29 58,2 41,4 95 RC2 22 57 54,5 107 RBU1 27 58,4 44,4 97 RBU2 20 55,7 50 85 4.2.2 Kết quả kiểm tra bằng Clustal W
Từng primer thiết kếđược sắp gióng cột với một trình tự cytochrome b đại diện của mỗi loài trâu, bò, heo, gà, dê, cừu. Kết quảđược trình bày ở bảng 4.3
Bảng 4.3: Kết quả sắp gióng cột bằng Clustal W của các primer với trình tự
cytochrome b các loài trâu, bò, heo, gà, dê, cừu
Độ tương đồng (%) Primer Trâu D82894 Bò AY885304 heo AM492576 Gà AB044984 Dê AB004070 cừu DQ903212 F1 100 100 83,33 75 83,33 87,5 F2 100 100 91,6667 75 91,6667 87,5 RC1 75,8621 100 79,3103 58,6207 89,6552 86,2069 RC2 72,7273 100 72,7273 68,1818 72,7273 77,2727 RBU1 100 81,4815 81,4815 77,7778 88,8889 88,8889 RBU2 100 75 75 65 60 70 4.2.3 Kết quả BLAST
Trình tự các primer ở bảng 4.1 được BLAST trên NCBI. Kết quả cho thấy trình tự các primer tương đồng với trâu và bò rất cao (100%). Không có sự tương đồng với các loài động thực vật khác thường sử dụng trong chế biến thức ăn gia súc như lúa, ngô, đậu nành, mì…
4.3 Kết quả kiểm tra trên thực tếđộđặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC 4.3.1 Bằng PCR 4.3.1 Bằng PCR
Với 2 forward primer (F1, F2), 2 reverse primer trâu (RBU1, RBU2), và 2 reverse primer bò (RC1, RC2) thì có tất cả 8 tổ hợp primer để phát hiện trâu, bò (bảng 4.4).
Bảng 4.4: Các tổ hợp primer TT Tổ hợp Thành phần Kích thước sản phẩm khuếch đại (bp) 1 A F1 & RBU1 465 2 B F1& RBU2 553 3 C F1 & RC1 125 4 D F1 & RC2 629 5 E F2 & RBU1 675 6 F F2 & RBU2 763 7 G F2 & RC1 335 8 H F2 & RC2 839
Các cặp primer ở bảng 4.4 được kiểm tra độ đặc hiệu bằng phản ứng PCR. Thành phần phản ứng và quy trình nhiệt giống nhau, chỉ khác nhau ở DNA template. Dựa vào Tm của các primer (bảng 4.2),đề tài chọn nhiệt độ bắt cặp (Ta) để kiểm tra
độ đặc hiệu primer là 54oC. Thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 3.4. Quy
trình nhiệt như sau: tiền biến tính 94oC/4’, 35 chu kỳ: biến tính ở 94oC/1’, bắt cặp ở
54oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’, kéo dài cuối cùng ở 72oC/5’. Theo Sambrook & Russell (2000), thời gian kéo dài 1 phút cho DNA mục tiêu khoảng 1000bp. Trong nghiên cứu này, đoạn DNA mục tiêu của trâu dài 763 bp, còn của bò dài 839 bp. Do đó, chọn thời gian kéo dài 1 phút là tương đối phù hợp.
Mục tiêu của thí nghiệm này là tìm ra primer bò đặc hiệu (chỉ khuếch đại DNA bò) và primer trâu đặc hiệu (chỉ khuếch đại DNA trâu). Kết quả kiểm tra từng tổ hợp primer được lần lượt trình bày như sau:
4.3.1.1 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A và B
Kết quả ở hình 4.6 cho thấy 2 tổ hợp primer A (F1&RBU1) và B (F1&RBU2) không đặc hiệu. Chúng có thể khuếch đại DNA các loại thịt dê, gà, heo, cừu. Vì thế 2 tổ hợp này đã bị loại.
4.3.1.2 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C và D
Kết quảở hình 4.7. Tương tự như 2 tổ hợp A và B, 2 tổ hợp C và D cũng bị loại
4.3.1.3 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E và F
Kết quảở hình 4.8 cho thấy tổ hợp E không đặc hiệu vì có thể bắt cặp với DNA của bò, gà, dê, cừu. Còn tổ hợp F (F2&RBU2) có thể phát hiện cả thịt bò và trâu ở Ta = 54oC nhưng band bò hơi mờ hơn band trâu. Tuy nhiên, khi tăng Ta lên 56oC thì tổ
hợp primer này trở nên đặc hiệu hơn, chỉ phát hiện thịt trâu (Hình 4.10). Nhiệt độ bắt cặp ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của primer vì tăng nhiệt độ bắt cặp làm giảm sự kéo dài sai của những nucleotide ở đầu 3’ của primer (Michael & ctv, 1990). Vậy tổ hợp primer F được chọn cho PCR-trâu ở Ta = 56oC.
4.3.1.4 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G và H
Kết quả ở hình 4.1 cho thấy tổ hợp G có thể phát hiện cả thịt dê và cừu nên không đặc hiệu. Còn tổ hợp H (F2&RC2) chỉ phát hiện thịt bò nên đặc hiệu. Vì thế, tổ
hợp H được chọn cho PCR-bò ở Ta = 54oC.
Hình 4.1: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A (F1-RBU1) và B (F1-RBU2)
A1- bò, A2- heo, A3- gà, A4- dê, A5- cừu, A6- trâu+bò, A7-6 con, A8- trâu, B1- bò, B2- heo, B3- gà, B4- dê, B5- cừu, B6- trâu+bò, B7- 6 con, B8- trâu
Hình 4.2: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C (F1-RC1) và D (F1-RC2)
C1- trâu, C2- heo, C3- gà, C4- dê, C5- cừu, C6- trâu+bò, C7- 6 con, C8- bò, D1- trâu, D2- heo, D3- gà, D4- dê, D5- cừu, D6- trâu+bò, D7- 6 con, D8- bò
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 LAD B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8
465bp 553bp
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 LAD D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8
125bp
Hình 4.3: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E (F2-RBU1)và F (F2-RBU2)
E1- bò, E2- heo, E3- gà, E4- dê, E5- cừu, E6- trâu+bò, E7- 6 con, E8- bò, F1- bò, F2- heo, F3- gà, F4- dê, F5- cừu, F6- trâu+bò, F7- 6 con, F8- trâu
Hình 4.4: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G ((F2-RC1) và H (F2-RC2)
G1- trâu, G2- heo, G3- gà, G4- dê, G5- cừu, G6- trâu+bò, G7- 6 con, G8- bò, H1- trâu, H2- heo, H3- gà, H4- dê, H5- cừu, H6- trâu+bò, H7- 6 con, H8- bò
Hình 4.5: Kiểm tra độđặc hiệu primer F2 &RBU2 (Ta=56oC)
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 LAD F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
675bp 763bp
G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 LAD H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8
335bp
839bp
Heo gà trâu bò lad trâu+bò 6con dê cừu (-) 763bp
100bp
4.3.1.5 Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua
Cặp primer F2&RBU2 được chọn cho PCR-trâu, F2 &RC2 được chọn cho PCR- bò được kiểm tra lại với các DNA template khác nhau của các loài có thể có trong thức
ăn như lúa, bắp, đậu nành, cà chua, mè. Kết quả cho thấy âm tính (hình 4.6a và hình 4.6b). Điều này một lần nữa khẳng định rằng cặp primer F2&RBU2, F2&RC2 đặc hiệu để phát hiện thịt trâu, thịt bò trong thức ăn có các nguyên liệu tinh bột (lúa, bắp) và đậu nành, mè.
Hình 4.6: Kiểm tra độđặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua
(a) F2&RBU2 với lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua, bắp: 1-lúa, 2-lúa, 3-đậu phộng, 4- đậu nành, 5-ladder, 6-mè, 7-cà chua, 8-bắp
(b) F2&RC2 với lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua, bắp:1- lúa, 2-lúa, 3-đậu phộng, 4-đậu nành, 5-ladder, 6-mè, 7-cà chua, 8-bắp
4.3.2 Giải trình tự sản phẩm PCR của cặp F&RB; F&RC đặc hiệu Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR của cặp F2&RBU2 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR của cặp F2&RBU2
Sản phẩm PCR được điện di ở hình 4.5 ở giếng thứ 3 (sản phẩm PCR-trâu khuếch đại từ thịt trâu) được giải trình tự. Kết quả như sau:
1 TTTCATCTGC TTATATATAC ACGTAGGACG AGGCATATAC TACGGATCAT ATACCTTTCT 61 AGAAACATGA AACATCGGAG TAATCCTACT ATTCGCAGTA ATAGCCACAG CATTTATAGG 121 ATACGTACTG CCATGAGGAC AAATATCATT CTGAGGGGCA ACAGTCATCA CCAACCTTCT 181 CTCAGCAATC CCATACATTG GTACAAGTCT GGTTGAGTGA ATTTGAGGGG GATTCTCAGT 241 AGACAAAGCA ACCCTCACCC GATTCTTCGC ATTTCACTTC ATCCTCCCAT TCATTATCGC
(b)
1 2 3 4 5 6 7 8
(a)
301 AGCACTTGCA ATAGTCCACC TATTATTTCT CCACGAAACA GGATCCAACA ACCCAACAGG 361 AATCTCATCA GACACAGACA AAATCCCATT CCACCCCTAT TACACCATTA AAGACATCCT 421 AGGCGCCCTA CTATTAATCC TAGCCCTAAT ACTATTAGTA CTATTCGCAC CCGACCTCCT 481 CGGGGACCCA GACAACTACA CCCCAGCAAA CCCACTCAAC ACACCTCCCC ACATCAAGCC 541 TGAATGGTAC TTCCTATTCG
Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR của cặp F2&RC2
Kết quả PCR được điện di ở hình 4.4 ở giếng H8 được giải trình tự. Kết quả
như sau:
1 TGAACTACGG CTGAATCATC CGATACATAC ACGCAAACGG AGCTTCAATG TTTTTTATCT 61 GCTTATATAT GCACGTAGGA CGAGGCTTAT ATTATGGGTC TTACACTTTT CTAGAAACAT 121 GAAATATCGG AGTAATCCTT CTGCTCACAG TAATAGCCAC AGCATTCATA GGATACGTCC 181 TACCATGAGG ACAAATATCA TTCTGAGGAG CAACAGTCAT CACCAACCTC TTATCAGCAA 241 TCCCATACAT CGGCACAAAT TTAGTCGAAT GAATCTGAGG CGGATTCTCA GTAGACAAAG 301 CAACCCTTAC CCGATTCTTC GCTTTCCATT TTATCCTTCC ATTTATCATC ATAGCAATTG 361 CCATAGTCCA CCTATTATTC CTCCACGAAA CAGGCTCCAA CAATCCAACA GGAATCTCCT 421 CAGACGTAGA CAAAATCCCA TTCCACCCCT ACTATACCAT TAAGGACATC TTAGGGGCCC 481 TCTTACTAAT TCTAGCTCTA ATACTACTAG TACTATTCGC ACCCGACCTC CTCGGAGACC 541 CAGATAACTA CACCCCGGCC AATCCACTCA ACACACCTCC TCACATCAAA CCCGAATGAT 601 ACTTCTTATT TGCATACGCA ATCTTACGAT CAATCCCCAA CAAACTAGGA GGAGTACTAG 661 CCCTAGCCTTCTCTATCCTAATTCTTGCTCTAATCCCCCTACTACACACC
4.3.3 Xác nhận sản phẩm khuếch đại là của thịt trâu và bò 4.3.3.1 BLAST 4.3.3.1 BLAST
Trình tự sản phẩm PCR-trâu, PCR-bò lần lượt BLAST lên NCBI. Kết quả cho thấy ¾ Trình tự sản phẩm PCR-trâu hoàn toàn tương đồng với nhiều trình tự
cytochrome b của trâu trên ngân hàng gen.
¾ Trình tự sản phẩm PCR-bò hoàn toàn tương đồng với nhiều trình tự cytochrome b của bò trên ngân hàng gen
Điều này khẳng định PCR-trâu phát hiện được thịt trâu, PCR-bò phát hiện được thịt bò
4.3.3.2 Gởi mã số lên NCBI cho trình tựđoạn DNA của thịt trâu và bò
¾ Mã số một phần đoạn gen cytochrome b của trâu: GQ154521 ¾ Mã số một phần đoạn gen cytochrome b của bò: GQ358783
4.4 Xác định quy trình PCR-trâu
Từ kết quả kiểm tra độđặc hiệu tổ hợp primer F (F2&RBU2) ở mục 4.3.1.3 suy ra quy trình PCR-trâu như sau:
¾ Thành phần hóa chất như bảng 3.1
¾ Quy trình nhiệt: tiền biến tính 94oC/4’, 35 chu kỳ: biến tính ở 94oC/1’, bắt cặp ở
56oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’, kéo dài cuối cùng ở 72oC/5’
4.5 Xác định quy trình PCR-bò
Từ kết quả kiểm tra độđặc hiệu của tổ hợp primer H (F2 & RC2) ở mục 4.3.1.4 suy ra quy trình PCR-bò như sau:
¾ Thành phần hóa chất như bảng 3.1
¾ Quy trình nhiệt: tiền biến tính 94oC/4’, 35 chu kỳ: biến tính ở 94oC/1’, bắt cặp ở
54oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’, kéo dài cuối cùng ở 72oC/5’
4.6 Ứng dụng PCR-trâu, PCR-bò 4.6.1 Ứng dụng PCR-trâu 4.6.1 Ứng dụng PCR-trâu
4.6.1.1 Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu
Thực hiện PCR-trâu với DNA template là 12 nồng độ (bắt đầu với nồng độ 10 ng/μl, nồng độ sau giảm 10 lần so với nồng độ trước, nghĩa là từ 101 ng/μl xuống 10-10 ng/μl)
Hình 4.7: Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu
Kết quảở hình 4.7 cho thấy nồng độ thấp nhất của DNA trâu mà PCR trâu có thể phát hiện được là 0,001 ng/μl
101 100 10-1 10-2 10-3 10-4 Lad 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10
4.6.1.2 PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu cừu
Hình 4.8: PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu
Kết quảở hình 4.8 cho thấy PCR trâu có thể phát hiện trâu ở hỗn hợp M1, M2, M3, M4, M5. PCR- trâu không phát hiện được trâu trong hỗn hợp M6, M7. Điều này có nghĩa là đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu thì PCR-trâu có thể phát hiện được trâu ở tỷ lệ 0,1 % (M5)
4.6.1.3 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt
Hình 4.9: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt
Kết quả ở hình 4.9 cho thấy đối với hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt, tỷ lệ thịt trâu thấp nhất mà PCR-trâu có thể phát hiện là 0,1% (N5). 500bp M1 M2 M3 M4 LAD M6 M5 M7 N1 N2 N3 N4 LAD N5 N6 N7 763bp 763bp
4.6.1.4 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt
Từ kết quả ở hình 4.10, hình 4.11, hình 4.12 cho thấy với 6 nhóm nhiệt độ và thời gian xử lý là 80oC/15’; 120oC/15’; 120oC/30’; 130oC/15’; 130oC/30’, 180oC/15’, PCR-trâu có khả năng phát hiện thịt trâu trong tất cả các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở
80oC/15’; 120oC/15’. Đối với các hỗn hợp thịt được xử lý ở 130oC/15’ và 180oC/15’ thì PCR-trâu chỉ có thể phát hiện đến tỷ lệ thấp nhất là 0,1% (M5.5 và M7.5), tương