Các cặp primer dùng phát hiện riêng biệt thịt bò và trâu đã được thiết kế theo các bước sau:
- Tìm trình tự gen cytochrome b của heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
- Sắp gióng cột các trình tự cytochrome b của mỗi loài bằng cách sử dụng ClustalW online (http://align.genome.jp) nhằm xem xét sự tương đồng ở mỗi loài. - Lấy đại diện mỗi loài heo, gà, dê, cừu, bò một trình tự gen cytochrome b để kiểm
tra sự tương đồng với forward primer (FSIM) bằng ClustalW.
- Lấy đại diện trình tự gen cytochrome b của mỗi loài heo, gà, dê, cừu, bò để kiểm tra sự tương đồng với từng reverse primer của Matsunaga và ctv (1998).
- Sử dụng trình tự cytochrome b trâu có mã số D82894 và bò có mã số AY885304
để thiết kế forward primer chung cho bò và trâu (dựa vào vùng tương đồng của gen cytochrome b bò và trâu nhưng không tương đồng với các loài khác như heo, gà, dê, cừu), reverse primer trâu và reverse primer bò (dựa vào vùng không tương
đồng của gen cytochrome b bò, trâu và các loài khác). Dự định sẽ thiết kế 2 forward primer chung cho bò và trâu (F1, F2), 2 reverse primer trâu (RBU1, RBU2), 2 reverse primer bò (RC1, RC2)
- Kiểm tra và lựa chọn các primer vừa thiết kế trên lý thuyết: kiểm tra sự bắt cặp giữa các primer, sự tương đồng của primer với các loài bằng FASTPCR, BLAST. - Trình tự các primer F, RBU và RC đã thiết kế được tổng hợp bởi công ty
Integrated Device Technology (IDT), Mỹ.
3.4.3.2 Kiểm tra và lựa chọn các primer vừa thiết kế trên lý thuyết
được thực hiện nhờ FASTPCR, BLAST. ¾ Kiểm tra bằng FASTPCR
FASTPCR là phần mềm thiết kế primer và kiểm tra primer. Các primer trong nghiên cứu này được thiết kế thủ công và kiểm tra lại bằng FASTPCR ở các thông số
như: chiều dài, Tm, %CG, Q (primer quality), primer dimer… ¾ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Trình tự primer thiết kếđược BLAST lên NCBI để kiểm tra mức độ tương đồng với trình tự của trâu và bò trên ngân hàng gen của NCBI.