3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu
Mỗi loại thịt được lấy khoảng 500g cho vào từng túi nilon sạch kích thước 5 x 10 cm, dán nhãn cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thí nghiệm, trữở
-700C.
Mẫu bột xương thịt được lấy khoảng 6 mẫu (100g/mẫu) từ các công ty chế
biến thức ăn gia súc.
3.4.2 Tách chiết DNA
Sau khi rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng, việc tách chiết DNA được thực hiện theo dẫn liệu của Lương Quý Phương (2006). Cho khoảng 0,1g mẫu vào eppendorf 1,5 ml, dùng chày nghiền nhuyễn mẫu; cho vào 60 μl dung dịch đệm tách chiết (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA và 1% SDS, pH 8) và 3 μl dung dịch protease K (20 mg/ml); hỗn hợp được ủ ở 55oC trong 1 giờ. Sau đó, thêm vào hỗn hợp 375μl nước cất khử ion vô trùng, vortex 30 giây. Cho vào hỗn hợp 200 μl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); vortex trong 1 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 100C. Lấy phần nước nổi bên trên chuyển vào eppendorf mới đã có sẵn 1ml dung dịch cồn tuyệt đối; trộn đều; ủ -20oC trong 1 giờ. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC; phần cặn được đểở nhiệt độ phòng cho
đến khi khô hoàn toàn. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70%. Sau khi làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC, cho vào ống 200 μl dung dịch TE và ủ 55oC trong 2 giờ để làm tan cặn. Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được trữở - 20oC hoặc sử dụng ngay.
Độ tinh sạch DNA được kiểm tra bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Các
mẫu DNA được tách chiết có tỷ số OD260nm/OD280nm > 1,6 được sử dụng cho PCR. Hàm lượng DNA được ước lượng theo công thức:
DNA (ng/μl) = [62,9*OD260nm – 36*OD280nm]*độ pha loãng
3.4.3 Thiết kế và kiểm tra primer phát hiện thịt trâu và thịt bò
Với mục tiêu phân biệt thịt có nguồn gốc từ bò và trâu, các cặp primer dùng để
phát hiện thịt trâu và thịt bò được thiết kế dựa vào những vùng giống và khác nhau của gen cytochrome b, kiểm tra bằng FASTPCR, sau đó sắp gióng cột với những trình tự có sẵn trên ngân hàng gen bằng BLAST.
3.4.3.1 Thiết kế primer
Các cặp primer dùng phát hiện riêng biệt thịt bò và trâu đã được thiết kế theo các bước sau:
- Tìm trình tự gen cytochrome b của heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
- Sắp gióng cột các trình tự cytochrome b của mỗi loài bằng cách sử dụng ClustalW online (http://align.genome.jp) nhằm xem xét sự tương đồng ở mỗi loài. - Lấy đại diện mỗi loài heo, gà, dê, cừu, bò một trình tự gen cytochrome b để kiểm
tra sự tương đồng với forward primer (FSIM) bằng ClustalW.
- Lấy đại diện trình tự gen cytochrome b của mỗi loài heo, gà, dê, cừu, bò để kiểm tra sự tương đồng với từng reverse primer của Matsunaga và ctv (1998).
- Sử dụng trình tự cytochrome b trâu có mã số D82894 và bò có mã số AY885304
để thiết kế forward primer chung cho bò và trâu (dựa vào vùng tương đồng của gen cytochrome b bò và trâu nhưng không tương đồng với các loài khác như heo, gà, dê, cừu), reverse primer trâu và reverse primer bò (dựa vào vùng không tương
đồng của gen cytochrome b bò, trâu và các loài khác). Dự định sẽ thiết kế 2 forward primer chung cho bò và trâu (F1, F2), 2 reverse primer trâu (RBU1, RBU2), 2 reverse primer bò (RC1, RC2)
- Kiểm tra và lựa chọn các primer vừa thiết kế trên lý thuyết: kiểm tra sự bắt cặp giữa các primer, sự tương đồng của primer với các loài bằng FASTPCR, BLAST. - Trình tự các primer F, RBU và RC đã thiết kế được tổng hợp bởi công ty
Integrated Device Technology (IDT), Mỹ.
3.4.3.2 Kiểm tra và lựa chọn các primer vừa thiết kế trên lý thuyết
được thực hiện nhờ FASTPCR, BLAST. ¾ Kiểm tra bằng FASTPCR
FASTPCR là phần mềm thiết kế primer và kiểm tra primer. Các primer trong nghiên cứu này được thiết kế thủ công và kiểm tra lại bằng FASTPCR ở các thông số
như: chiều dài, Tm, %CG, Q (primer quality), primer dimer… ¾ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Trình tự primer thiết kếđược BLAST lên NCBI để kiểm tra mức độ tương đồng với trình tự của trâu và bò trên ngân hàng gen của NCBI.
3.4.3.3 Kiểm tra trên thực tếđộđặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC
Bằng PCR
Thực hiện phản ứng PCR từng cặp F & RB; F & RC với từng loại DNA template khác nhau của thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu; hỗn hợp DNA template trâu và bò; hỗn hợp DNA template gồm DNA thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu. Thành phần hóa chất phản ứng PCR kiểm tra độđặc hiệu primer theo bảng 3.1
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất phản ứng PCR kiểm tra độđặc hiệu primer Tên hóa chất Nồng độ cuối Dung dịch đệm PCR 1X MgCl2 2 mM F 10 pmol R(*) 10 pmol dNTP 200 μM/mỗi loại Taq 1 UI DNA mỗi loại 100 ng/1 phản ứng H2O cất Vừa đủ 30μl (*) RB/RC
Chu trình nhiệt sẽ phụ thuộc vào Tm của các primer và kích thước của sản phẩm cần khuếch đại.
Như vậy, cặp F – RB, F – RC đặc hiệu được chọn.
Cặp F-RB, F-RC đặc hiệu được kiểm tra bằng phương pháp PCR với các DNA template khác như lúa, đậu nành, đậu phộng, mè, cà chua, bắp... để khẳng định lại độ đặc hiệu của chúng.
Sản phẩm PCR của cặp F&RB, F&RC được gởi đến công ty Macrogene, Hàn Quốc giải trình tự.
Xác nhận sản phẩm khuếch đại
Kết quả giải trình tựđược BLAST lên NCBI để khẳng định lại chính xác sản phẩm khuếch đại là của trâu và của bò nhờ vào mức độ tương đồng cao với nhiều trình tự của trâu và bò trên ngân hàng gen của NCBI.
Cuối cùng, các chuỗi DNA thu được được gửi NCBI đểđăng ký mã số.
3.4.4 Xác định quy trình PCR- trâu và PCR-bò
Quy trình PCR-trâu, PCR-bò thích hợp là quy trình PCR-trâu, PCR-bò có primer đặc hiệu nhất trong việc phát hiện thịt trâu, thịt bò. Thành phần phản ứng, quy trình nhiệt cũng như cặp primer đặc hiệu cho PCR-trâu, PCR-bò như đã được xác
định trong thí nghiệm kiểm tra trên thực tếđộđặc hiệu các cặp primer ở mục 3.4.3.3.
3.4.5 Ứng dụng PCR-trâu, PCR-bò để phát hiện thịt trâu, bò
Các quy trình PCR-trâu, PCR-bò vừa được xây dựng ở mục 3.4.4 được dùng để
phát hiện thịt trâu và bò trong các loại mẫu thử nghiệm khác nhau: - Các hỗn hợp DNA và xác định giới hạn phát hiện
- Hỗn hợp thịt chế biến có xử lý nhiệt và không xử lý nhiệt. - Mẫu bột thịt
3.4.5.1 Ứng dụng PCR-trâu
a. Xác định giới hạn phát hiện của PCR-trâu
Nhằm xác định nồng độ DNA trâu thấp nhất mà PCR-trâu còn phát hiện được. Thực hiện PCR-trâu với DNA template là 12 nồng độ (bắt đầu với nồng độ 10ng/μl, nồng độ sau giảm 10 lần so với nồng độ trước, nghĩa là từ 101 ng/μl xuống 10-10 ng/μl)
b. PCR-trâu với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu
Mục tiêu của thí nghiệm là để tạo cơ sở cho việc phát hiện thịt trâu của PCR- trâu trong các hỗn hợp DNA khác nhau của nhiều loài và xác định ở nồng độ nào của DNA trâu mà PCR-trâu còn phát hiện được. Thí nghiệm thực hiện với DNA template
được phối trộn theo bảng 3.2
Lý do phối trộn với tỷ lệ theo bảng 3.5 như sau: Nguyên liệu để sản xuất bột thịt trong thức ăn gia súc chủ yếu là phế phẩm từ các lò mổ gia súc, gia cầm. Trong đó, phế phẩm của heo và gà là chủ yếu. Nên đề tài phối trộn tỷ lệ heo và gà bằng nhau và tăng dần. Còn thịt có nguồn gốc từ thú nhai lại có nguy cơ nhiễm bệnh BSE hoặc vì lý
do nào đó (ví dụ như tôn giáo, dị ứng..) mà người ta không muốn sử dụng thịt từ thú nhai lại. Nên đề tài phối trộn thịt trâu, bò, dê, cừu với tỷ lệ bằng nhau và giảm dần.
Bảng 3.2: Tỷ lệ DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp STT Kí hiệu hỗn hợp Tỷ lệ của hỗn hợp DNA 1 M1 30:30:10:10:10:10 2 M2 40:40:5:5:5:5 3 M3 48:48:1:1:1:1 4 M4 49:49:0,5:0,5:0,5:0,5 5 M5 49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1 6 M6 49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05 7 M7 49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03
c. PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt
Nhằm tạo cơ sở cho việc xác định mức độ biến tính của thịt trâu trong hỗn hợp thịt xử lý nhiệt, trước tiên tiến hành phát hiện thịt trâu trong hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt. Thí nghiệm này tiến hành với các hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt theo bảng 3.3.
d. PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt
Thí nghiệm này tiến hành với các hỗn hợp thịt chế biến xử lý nhiệt theo bảng 3.3
e. PCR-trâu với bột thịt trên thị trường
Bảng 3.3: Hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt
Kí hiệu hỗn hợp thịt chế biến xử lý nhiệt TT Tỷ lệ thịt heo, gà, trâu, bò, dê,
cừu trong các hỗn hợp Kí hiệu hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt 80oC/ 15’ 120oC/ 15’ 120oC/ 30’ 130oC/ 15’ 130oC/ 30’ 180oC/ 15’ 1 30:30:10:10:10:10 N1 M2.1 M3.1 M4.1 M5.1 M6.1 M7.1 2 40:40:5:5:5:5 N2 M2.2 M3.2 M4.2 M5.2 M6.2 M7.2 3 48:48:1:1:1:1 N3 M2.3 M3.3 M4.3 M5.3 M6.3 M7.3 4 49:49:0,5:0,5:0,5:0,5 N4 M2.4 M3.4 M4.4 M5.4 M6.4 M7.4 5 49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1 N5 M2.5 M3.5 M4.5 M5.5 M6.5 M7.5 6 49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05 N6 M2.6 M3.6 M4.6 M5.6 M6.6 M7.6 7 49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03 N7 M2.7 M3.7 M4.7 M5.7 M6.7 M7.7
3.4.5.2 Ứng dụng PCR-bò
a. Xác định giới hạn phát hiện của PCR-bò
Nhằm xác định nồng độ DNA bò thấp nhất mà PCR-bò còn phát hiện được. Thực hiện PCR-bò với DNA template là 12 nồng độ (bắt đầu với nồng độ 10ng/μl, nồng độ
sau giảm 10 lần so với nồng độ trước, nghĩa là từ 101 ng/μl xuống 10-10 ng/μl)
b. PCR-bò với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu
Mục tiêu của thí nghiệm là để tạo cơ sở cho việc phát hiện thịt bò của PCR-bò trong các hỗn hợp DNA khác nhau của nhiều loài và xác định ở nồng độ nào của DNA bò mà PCR-bò còn phát hiện được. Thí nghiệm thực hiện với DNA template được phối trộn theo bảng 3.2.
c. PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt
Nhằm tạo cơ sở cho việc xác định mức độ biến tính của thịt bò trong hỗn hợp thịt xử lý nhiệt, trước tiên tiến hành phát hiện thịt bò trong hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt. Thí nghiệm này tiến hành với các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt theo bảng 3.3.
d. PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt
Thí nghiệm này tiến hành với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt theo bảng 3.3.
e. PCR-bò với bột thịt trên thị trường
Sơđồ 3.1: Sơđồ nghiên cứu PCR-trâu, PCR-bò Xử lý nhiệt Không xử lý nhiệt Hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu - Chuẩn bị mẫu: Thịt tươi, thịt chế biến, bột thịt - Ly trích DNA Xây dựng quy trình PCR-trâu, PCR-bò
Ứng dụng quy trình PCR-trâu, PCR-bò đối với hỗn hợp DNA từ:
Thịt tươi Thịt chế biến Bột thịt
Chương 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả thiết kế và tổng hợp primer phát hiện thịt trâu, thịt bò
Kết quả sắp gióng cột các trình tự cytochrome b của trâu, bò lấy trên ngân hàng gen cho thấy tương đồng ở mỗi loài. Vì thế, tác giả lấy đại diện mỗi loài trâu, bò một trình tự cytochrome b để thiết kế primer:
¾ Cytochrome b trâu: D82894 (1140bp) ¾ Cytochrome b bò: AY885304 (1140bp)
Để tiết kiệm kinh phí, tác giả thiết kế foward primer chung cho cả trâu và bò (dựa vào vùng tương đồng cao của trâu và bò). Còn các reverse primer thì riêng biệt cho từng loài (dựa vào vùng không tương đồng của trâu và bò và với các loài khác). Tác giảđã thiết kế và gởi sang công ty IDT để tổng hợp 2 forward primer chung (F1, F2), 2 reverse primer trâu (RBU1, RBU2), 2 reverse primer bò (RC1, RC2) như bảng 4.1.
Bảng 4.1: Các primer thiết kế TT Tên Trình tự (5’-> 3’) Chiều dài Vị trí 1 F1 AGCCACAGCATTTATAGGATACGT 24 372 - 395 2 F2 CTACACATCCGACACAACAACAGC 24 162 -185 3 RBU1 GCGTATGCGAATAGGAAGTACCATTCA 27 810 - 836 4 RBU2 ATGTAGCAGGGGCATGAGAA 20 905 - 924 5 RC1 CTCAGATTCATTCGACTAAATTTGTGCCG 29 468 - 496 6 RC2 TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC 22 979 - 1000
4.2 Kết quả kiểm tra lý thuyết độđặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC 4.2.1 Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR 4.2.1 Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR
Kết quảở bảng 4.2 cho thấy tất cả các primer được thiết kếđều có Q > 80. Tm của các forward và reverse primer chênh lệch nhau không quá 3oC.
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR Primer Length Tm(oC) CG% Q F1 24 55,6 41,7 95 F2 24 58,2 50 104 RC1 29 58,2 41,4 95 RC2 22 57 54,5 107 RBU1 27 58,4 44,4 97 RBU2 20 55,7 50 85 4.2.2 Kết quả kiểm tra bằng Clustal W
Từng primer thiết kếđược sắp gióng cột với một trình tự cytochrome b đại diện của mỗi loài trâu, bò, heo, gà, dê, cừu. Kết quảđược trình bày ở bảng 4.3
Bảng 4.3: Kết quả sắp gióng cột bằng Clustal W của các primer với trình tự
cytochrome b các loài trâu, bò, heo, gà, dê, cừu
Độ tương đồng (%) Primer Trâu D82894 Bò AY885304 heo AM492576 Gà AB044984 Dê AB004070 cừu DQ903212 F1 100 100 83,33 75 83,33 87,5 F2 100 100 91,6667 75 91,6667 87,5 RC1 75,8621 100 79,3103 58,6207 89,6552 86,2069 RC2 72,7273 100 72,7273 68,1818 72,7273 77,2727 RBU1 100 81,4815 81,4815 77,7778 88,8889 88,8889 RBU2 100 75 75 65 60 70 4.2.3 Kết quả BLAST
Trình tự các primer ở bảng 4.1 được BLAST trên NCBI. Kết quả cho thấy trình tự các primer tương đồng với trâu và bò rất cao (100%). Không có sự tương đồng với các loài động thực vật khác thường sử dụng trong chế biến thức ăn gia súc như lúa, ngô, đậu nành, mì…
4.3 Kết quả kiểm tra trên thực tếđộđặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC 4.3.1 Bằng PCR 4.3.1 Bằng PCR
Với 2 forward primer (F1, F2), 2 reverse primer trâu (RBU1, RBU2), và 2 reverse primer bò (RC1, RC2) thì có tất cả 8 tổ hợp primer để phát hiện trâu, bò (bảng 4.4).
Bảng 4.4: Các tổ hợp primer TT Tổ hợp Thành phần Kích thước sản phẩm khuếch đại (bp) 1 A F1 & RBU1 465 2 B F1& RBU2 553 3 C F1 & RC1 125 4 D F1 & RC2 629 5 E F2 & RBU1 675 6 F F2 & RBU2 763 7 G F2 & RC1 335 8 H F2 & RC2 839
Các cặp primer ở bảng 4.4 được kiểm tra độ đặc hiệu bằng phản ứng PCR. Thành phần phản ứng và quy trình nhiệt giống nhau, chỉ khác nhau ở DNA template. Dựa vào Tm của các primer (bảng 4.2),đề tài chọn nhiệt độ bắt cặp (Ta) để kiểm tra
độ đặc hiệu primer là 54oC. Thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 3.4. Quy
trình nhiệt như sau: tiền biến tính 94oC/4’, 35 chu kỳ: biến tính ở 94oC/1’, bắt cặp ở
54oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’, kéo dài cuối cùng ở 72oC/5’. Theo Sambrook & Russell (2000), thời gian kéo dài 1 phút cho DNA mục tiêu khoảng 1000bp. Trong nghiên cứu này, đoạn DNA mục tiêu của trâu dài 763 bp, còn của bò dài 839 bp. Do đó, chọn thời gian kéo dài 1 phút là tương đối phù hợp.
Mục tiêu của thí nghiệm này là tìm ra primer bò đặc hiệu (chỉ khuếch đại DNA bò) và primer trâu đặc hiệu (chỉ khuếch đại DNA trâu). Kết quả kiểm tra từng tổ hợp primer được lần lượt trình bày như sau:
4.3.1.1 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A và B
Kết quả ở hình 4.6 cho thấy 2 tổ hợp primer A (F1&RBU1) và B (F1&RBU2) không đặc hiệu. Chúng có thể khuếch đại DNA các loại thịt dê, gà, heo, cừu. Vì thế 2