2.2.6.1. Ảnh hưởng của ñiều kiện khử trùng mẫu cấy
Việc khử trùng mẫu trước khi ñưa vào nuôi cấy là một vấn ñề cần thiết vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… tuy nhiên, mức ñộ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và ñặc ñiểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu ñược lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nguyên liệu ban ñầu.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………17 Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng ñộ, thời gian xử lý và mức ñộ xâm nhập của chất khử trùng vào các kẽ, những phần gồ gề trên bề mặt của mô cấy. ðể làm tăng hiệu quả người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70% trong 30 giây ñể làm tăng sức căng bề mặt mẫu rồi sau ñó mới khử trùng bằng dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường ñược sử dụng Một số hoá chất khử trùng thông dụng Chất khử trùng Nồng ñộ (%) Thời gian khử trùng (phút) Calcium hypocholorite 9- 10 5- 30 Sodium hypocholorite 0,5- 5 5- 30 Hydrogen peroxide 3- 12 5- 15 Bromime water 1- 2 2- 10 Ethyl alcohol 70- 95 0,2- 5,0 Silver nitrate 1 5- 30 Murcurric choloride 0,1- 1,0 2- 10 Benzalknium choloride 0,01- 0,1 5- 20
Thuỷ ngân clorua 0,1 2 - 40
Nguồn:Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, ðại học Quóc Gia thành phố Hồ Chí Minh
ðối với các mẫu quá bẩn, việc rửa kỹ bằng nước xà phòng và ñể dưới vòi nước chảy từ 20 ñến 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm ñáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy [32].
Thời gian khử trùng là một ñiều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và ñặc ñiểm của từng loại mẫu cấy. Với hypochlorit, người ta thường khử trùng trong thời gian 15 - 30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………18 gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu bị nhiễm khuẩn.
ðể ñạt hiệu quả cao trong khử trùng cho một số mẫu nuôi cấy người ta không chỉ sử dụng một loại hoá chất mà còn sử dụng kết hợp nhiều loại ñã cho kết quả rất khả quan như ở cây kiwi, cây lát hoa côn ñảo…, khử trùng hypo-Na sau ñó mới khử trùng bằng HgCl2 [18, 27]
Sau khi khử trùng thu ñược nguồn nguyên liệu vô trùng, các mẫu cấy ñược chuyển sang các môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng ñể thực hiện công ñoạn nhân nhanh. Năng suất nhân nhanh phụ thuộc vào quá trình tác ñộng của các chất ñiều tiết sinh trưởng.
2.2.6.2 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng
Các chất ñiều tiết sinh trưởng ñược dùng phổ biến nhất hiện nay là auxin và cytokinin.
• Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc ñẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hoá sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao ñổi chất, tham gia ñiều chỉnh sự phân hoá của rễ, chồi…[22].
Các auxin ñược sử dụng với nồng ñộ thấp từ 10-6 - 10-1 M tuỳ theo từng chất mục ñích và ñối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hoá rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo.
Auxin ñược chia thành hai nhóm do có nguồn gốc khác nhau. Trong ñó, auxin tự nhiên quan trọng nhất là IAA, nhưng nó chỉ ñược dùng trong một số môi trường nuôi cấy vì IAA không ổn ñịnh với nhiệt ñộ và ánh sáng. Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA ñược sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA, NAA, Dicamba, 2,4,5-T, MCPA, Picloram… [30].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………19 bào, cảm ứng hình thành chồi cây và loại bỏ ưu thế ngọn [22]
Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin ñược dùng ñể kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng ñộ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ [23]. Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm ñược sử dụng trong môi trường nuôi cấy ñó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenin). Nhưng chúng không ñược dùng phổ biến vì rất ñắt (ñặc biệt là zeatin) và không ổn ñịnh [22]. Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP ñược sử dụng thông dụng hơn. Các chất hoá học không có based purin nhưng thay thế bằng phenylureas, cũng ñược sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.
Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone [30]. Do vậy khi sử dụng các chất ñiều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần ñặc biệt lưu tâm tới vấn ñề này. Nhiều tác giả ñã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ, nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc ñẩy hình thành chồi, ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo [28].
Ngoài các chất kích thích sinh trưởng nguồn cacbon bổ sung cũng có tác ñộng ñến quá trình nuôi cấy, ảnh hưởng ñến chất lượng mẫu cấy và quá trình phát sinh hình thái mẫu.
2.2.6.3 Ảnh hưởng của nồng ñộñường
Ở mô và tế bào nuôi cấy sự quang hợp thường bị hạn chế do vậy, cần bổ sung nguồn cacbon cho mô tăng trưởng. ðường vừa là nguồn các bon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, ñồng thời còn tham gia ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. ðường ñóng góp khoảng 50 - 70% vào khả năng thẩm thấu của môi trường [13]. Thông thường ñường saccharose ñược sử dụng ở nồng ñộ 2 - 3%, nhưng nồng ñộ này có sự thay ñổi ở từng ñối tượng khác nhau và mục ñích nuôi cấy khác nhau có khi xuống tới 2% (tạo dòng), có khi tăng lên
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………20 ñến 12% (gây cảm ứng stress nước).
Sự hình thành rễ ñòi hỏi một lượng ñường ñược cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh vì thực chất sự ra rễ là một quá trình hô hấp. Ở hầu hết các loài thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng ñường 20 - 30 g/lít [21].
Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro ñã phát triển tốt trên môi trường không có ñường và vitamin, ñộ thoáng khí cao, tỷ lệ nhiễm nấm giảm ñáng kể, cây có diện tích lá lớn hơn và sự ñóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp ñiều kiện thay ñổi của môi trường. Trong khi ñó cây nuôi cấy theo ñiều kiện truyền thống (có ñường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ ñiều kiện in vitrro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95 - 100 % sau một tháng ở vườn ươm ñối với cây nuôi cấy trên môi trường không có ñường, trái lại chỉ từ 70 - 80% theo phương pháp truyền thống [21].
Nghiên cứu nhằm tăng năng suất nhân nhanh cũng như chất lượng các mô tế bào nuôi cấy in vitro, người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhiều thành phần khác. Trong ñó, than hoạt tính là thành phần rất ñược quan tâm vì có nhiều tác ñộng tích cực cho nuôi cấy.
2.2.6.4 Ảnh hưởng của than hoạt tính
Than hoạt tính ban ñầu ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñể cố gắng mô phỏng ñiều kiện trồng trọt sau ñó, nó ñược sử dụng rất rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy. Tác dụng của than hoạt tính với các mẫu cấy in vitro là tỷ lệ cây sống cao, cây sinh trưởng tốt, cải thiện chất lượng và ñộ khoẻ của cây.
Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật ñó là, sự hút thấm bề mặt của thành phần môi trường, hút thấm các thành phần không sạch của agar, hút thấm hoặc giải phóng chất ñiều hoà sinh trưởng, làm ñen môi trường, ảnh hưởng tới pH môi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………21 trường, xúc tác bẻ gãy ñường saccharose trong khử trùng . ðiều tra tác dụng của than hoạt tính trong khử trùng và sự thuỷ phân ñường trong môi trường nuôi cấy cho thấy. Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose tỷ lệ ñường thuỷ phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 % còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20% [21]. Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy. Ngoài ra than hoạt tính còn ñược công nhận là có tác dụng kích thích sự phát triển của mô in vitro như kích thích tạo củ của trinh nữ hoàng cung [1], tác dụng hình thành rễ ở cây bạch ñàn, trầm hương [7].
Sau khi ñã tạo ñược cây hoàn chỉnh có chất lượng tốt, các cây in vitro
này ñược chuyển ra ngoài môi trường tự nhiên, giai ñoạn này gặp nhiều khó khăn và có ảnh hưởng rất lớn ñến năng suất nuôi cấy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.6.5. Ảnh hưởng của ñiều kiện ra cây
ðây là giai ñoạn quan trọng nhằm ñưa cây nuôi cấy ra ngoài ñiều kiện tự nhiên, huấn luyện cây thích nghi với các ñiều kiện nhiệt ñộ, ẩm ñộ, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế ñộ dị dưỡng sang chế ñộ tự dưỡng. ðối với một số cây có thể chuyển chồi chưa có rễ ra ñất nhưng với ña số các loài cây trồng thì chỉ sau khi chồi ñã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới ñược cấy chuyển ra vườn ươm. Quá trình thích nghi dần với ñiều kiện ngoài vườn ươm cây con cần ñược chăm sóc ñặc biệt.
- Cây ñược trồng trong ñiều kiện ñược bảo vệ và ñược cung cấp ñủ ẩm bằng cách tưới phun sương.
- Giá thể trồng có thể là ñất mùn, ñất cát hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa ñất
- Các chất dinh dưỡng bón bổ sung thường ở dạng dung dịch phun qua lá Khi ñã xác ñịnh ñược toàn bộ cách thức và các yếu tố cần thiết cho
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………22 nuôi cấy thì có thể tạo ra ñược một quy trình sản xuất cây giống với quy mô công nghiệp hợp lý. Mặc dù với mỗi ñối tượng có sai khác nhưng qua quá trình nghiên cứu và sản xuất cây giống từ cây nuôi cấy mô ñã tổng kết quá trình này cơ bản có những bước chung.