3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ
3.3.1 Phương pháp lấy mẫu, xử lý khử trùng và nuôi cấy mẫu
- Phương pháp lấy mẫu: Cây ñược lựa chọn ñể lấy mẫu là những cây sinh trưởng khoẻ không bị sâu bệnh thường ñược lấy vào buổi sáng của ngày khô và có nắng trên mỗi cây lựa chọn chồi ñỉnh khoẻ tương ñối ñồng ñều nhau.
- Phương pháp xử lý khử trùng mẫu ñược tóm tắt qua các bước sau: + Rửa nhiều lần bằng nước sạch, tránh làm dập mẫu
+ Ngâm trong nước xà phòng loãng khoảng 5 - 7 phút + Rửa sạch xà phòng
+ Tráng lại bằng nước cất
+ Mang mẫu vào phòng cấy, tráng lại bằng nước cất vô trùng + Khử trùng
. Tráng qua cồn 750 trong thời gian 20 giây . Tráng lại bằng nước cất vô trùng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………33 0, 15% trong thời gian từ 5 - 15 phút tuỳ từng công thức khử trùng
. Tráng lại bằng nước cất vô trùng từ 4-5 lần . Ngâm trong nước cất vô trùng 15 phút
Trong quá trình khử trùng, mẫu cấy ñược ngâm ngập hoàn toàn trong môi trường xử lý.
ðể tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy cần ñể lại một lớp màng mỏng bọc ngoài khi ngâm mẫu vào dung dịch diệt khuẩn, lớp cuối cùng này sẽ ñược cất bỏ hoặc bóc ñi trước khi ñặt mô lên môi trường nuôi cấy.
Những phần mô bị tác nhân vô trùng làm trắng ra cũng cần ñược cắt bỏ trước khi cấy mẫu vào môi trường.
- Phương pháp nuôi cấy:
Các mẫu cấy sau khi ñã khử trùng ñược ñưa vào ống nghiệm chứa môi trường không chứa chất ñiều tiết sinh trưởng.
Chồi tái sinh một số lượng nhất ñịnh ñược chọn ra những chồi trội và cấy chúng vào các bình tam giác chứa môi trường MS có bổ sung các chất ñiều tiết sinh trưởng ở những nồng ñộ khác nhau tuỳ thuộc vào mục ñích từng thí nghiệm.
Các mẫu xuyên khung trong thí nghiệm ñược nuôi cấy trong ñiều kiện nhân tạo của phòng nuôi có quang chu kỳ là 14 giờ sáng/10giờ tối, cường ñộ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt ñộ phòng 25 ± 20 C.
Khi cây ñạt yêu cầu về chiều cao (5- 6cm), số lá 3 - 4 lá, 3 - 4 rễ, kích thước rễ 1,5 - 2 cm ñược ñưa ra nhà màn cách ly và ñược trồng trên ba loại giá thể khác nhau.