2.2.7.1. Chuẩn bị mẫu làm vật liệu khởi ñầu
ðây là gia ñoạn rất quan trọng, cần ñặc biệt chú ý vì những ñặc tính của vật liệu khởi ñầu sẽ ñược duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Giai ñoạn này bao gồm các khâu:
- Chọn lọc cây mẹ ñể lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khoẻ, có giá trị kinh tế cao
- Chọn cơ quan ñể lấy mẫu, thường là chồi non, ñoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non và hạt
- Chọn mô ñể nuôi cấy, mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm sạch bệnh, giữ ñược các ñặc tính ưu việt của cây mẹ, ít có nguy cơ biến dị.
2.2.7.2. Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng
ðây là giai ñoạn ñưa các mẫu nuôi cây vào quá trình sản xuất vô trùng gồm các khâu sau:
- Khử trùng bề mặt mẫu vật
- Cấy mẫu ñã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường nhân tạo
Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ ñược lưu giữ trong phòng nuôi cấy với ñiều kiện nhiệt ñộ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất ñịnh, từ mẫu nuôi cấy bắt ñầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có ñặc tính gần như phôi hữu tính. Sau một thời gian nhất ñịnh tuỳ thuộc vào loại cây, mẫu cấy ñó
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………23 ñược chuyển sang giai ñoạn tiếp theo.
2.2.7.3. Nhân nhanh chồi
Khi mẫu cấy sạch ñã ñược tạo ra, từ ñó nhân lên thành các cụm chồi hoặc các phôi vô tính sinh trưởng tốt quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai ñoạn sản xuất. Giai ñoạn này cần tạo ra tốc ñộ nhân nhanh cao nhất trong ñiều kiện nuôi cấy vì vậy, thành phần và ñiều kiện môi trường phải ñược tối ưu nhằm ñạt ñược mục tiêu nhân nhanh. Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng từ một ñến hai tháng tháng tuỳ loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển ñạt khoảng 2- 8 lần/lần cấy chuyển. Giai ñoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban ñầu không nên kéo dài quá lâu ñể tránh biến dị soma.
Ví dụ: từ một chồi cây chuối chọn lọc ban ñầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 - 3000 chồi cây sau 7 - 8 lần cấy chuyển [26].
Các chồi nhân nhanh cần ñược chuyển sang môi trường tạo rễ ñể tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
2.2.7.4. Tạo rễ
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh nhưng thông thường các chồi này phải ñược cấy chuyển sang một môi trường khác ñể kích thích tạo rễ. Ở một số loài khác thì các chồi sẽ tạo rễ khi ñược chuyển trực tiếp ra ñất. Giai ñoạn này trong vòng từ 2 - 8 tuần. Sau khi cây ñã ñược tái sinh hoàn chỉnh sẽ ñược ñưa trở về ñiều kiện tự nhiên ñể sản xuất ñại trà.
ðể cây thích ứng ñược với ñiều kiện tự nhiên vốn rất khác biệt so với ñiều kiện phòng nuôi cần rất lưu ý ñến quá trình chuyển cây ra vườn ươm.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………24 ðây là giai ñoạn ñầu tiên chuyển cây từ ñiều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ñiều kiện ngoài tự nhiên. Cây cần ñược chăm sóc cẩn thận ñể ñạt tỷ lệ sống cao. Giai ñoạn này ñòi hỏi từ 4 - 16 tuần tuỳ từng ñối tượng nghiên cứu.