Trong nuôi cấy bao phấn tuỳ theo mỗi loại cây trồng mà thu ñựơc tỷ lệ
cây ñơn bội và nhị bội khác nhau, trong một vài trường hợp có thể thu ñược cây có mức ñộ bội thể cao hơn (Chu & Cs, 1982) [27]. Các bao phấn dùng ñể
nuôi cấy thường ñược lấy từ các cây của quần thể F1 hoặc F2 nhằm tạo ra sự ña dạng di truyền tối ña trong quần thể những cây ñơn bội ñược tạo thành. Nhiễm sắc thể của cây ñơn bội thông qua nuôi cấy hạt phấn F1, sau khi lưỡng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………19 bội hoá sẽ trở thành cây lưỡng bội thuần chủng, từ các cây này sẽ tạo thành quần thể các dòng thuần, qua ñánh giá chọn lọc và cho ra giống mới (Singsit và CS, 1990)[50].
Tác giả Brasiluro và cộng sự (1999) ñã tiến hành thí nghiệm nghiên cứu giai ñoạn phát triển của bao phấn và ảnh hưởng của xử lý tia gamma trên bao phấn cà chua ñến sự hình thành callus. Kết quả thí nghiệm cho thấy hạt phấn trong tế bào phân chia tiền kỳ I sinh ra nhiều calus nhất. Bao phấn và chiều dài nụ hoa ñều có ý nghĩa quan trọng liên quan ñến giai ñoạn phát triển bao phấn. Trong thí nghiệm xử lý tia gamma, các tác giả ñã xử lý hạt và nụ
hoa cà chua của con lai IPA 5x Rotam4 (F2), IPA6x Rotam4 (F2) và ñem cấy trên môi trường Gresshoff và Doy (1972) có bổ sung các chất ñiều hoà sinh trưởng khác nhau. Tuy nhiên, các tác giả không tìm thấy sự sai khác có ý nghĩa ñến sự hình thành callus [23] .
ðối với các cây trong họ bầu bí kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ñể tạo cây
ñơn bội cũng ñược nhiều nhà khoa học ñã tập trung nghiên cứu và ñã thu
ñược những thành công nhất ñịnh. Tuy nhiên, dòng ñơn bội kép ñược tạo ra thông qua nuôi cấy bao phấn còn nhiều hạn chế [34], [19], [30]. Những yếu tố
như ñặc tính di truyền, ñiều kiện trồng của cây mẹ, giai ñoạn phát triển của tiểu bào tử, xử lý nụ hoa trước khi nuôi cấy, môi trường và ñiều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng ñến kết quả của quá trình nuôi cấy bao phấn [21].
Với cây dưa hấu tác giả Xue và cộng sự (1989) cho rằng tiến hành lấy hoa khi bao phấn ở giai ñoạn một nhân, có kích thước 5 mm và nụ hoa có tràng hoa nhìn rõ sẽ cho hiệu quả nuôi cấy tốt nhất. Callus phát sinh trên môi trường MS muối có bổ sung 2ppm BA + 2ppm Ki + 3 succarose + 6-7% agar
ở pH 5,8. Sự phát sinh cơ quan thu ñược bằng nuôi cấy callus trên môi trường MS muối có bổ sung agar + 5-10 ppm GA3 + 4ppm BA + 30-40 ppm adenine + 500ppm lactalbumin hydrolysate. Sự phát sinh cơ quan chuyên hoá
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………20 và sự phát triển chồi thu ñược trên môi trường nuôi cấy MS + 2ppm Triaconital. Rễ phát sinh trên môi trường agar + ½ MS + 0,2ppm IBA + 1ppm IAA + 1,5% succarose + pH 5,7. Mặc dù tần suất rất thấp nhưng họ vẫn thu
ñược cây ñơn bội và ñơn bôi kép qua quá trình nuôi cấy [57].
Các nghiên cứu khác trên cây bí ngô E.I. Metwall cho thấy rằng khi nuôi cấy bao phấn cây ở giai ñoạn giữa và cuối của giai ñoạn hạt phấn một nhân ñược thu vào buổi sáng và xử lý ở nhiệt ñộ 40C trong 4 ngày, khử trùng nụ hoa bằng ethanol 70% trong 2 phút và trong Clorox 20% (5,2% sodium hypochlorite) trong 20 phút cấy trên môi trường MS + 150g succarose + 5mg/l 2,4D cho tỷ lệ tạo cây cao nhất. Rễ của 20 cây tạo ra ñược soi ở dưới kính hiển vi cho thấy 50% số cây là lưỡng bội và 50% số cây là ñơn bội [32].
Các tác giả Gemes Juhasz, G. Venczel, P. Balogh ñã tạo cây ñơn bội thông qua quá trình nuôi cấy noãn chưa thụ tinh của cây dưa chuột và cây bí xanh. Hoa cái ñược thu từ cây mẹ trồng trong nhà lưới có chiều dài 2–3 cm
ñối với cây bí xanh và 0,5 – 1 cm ñối với cây dưa chuột. Cắt thành từng lát cấy vào môi trường có bổ sung 0,02 mg/1 TDZ, môi trường phát sinh phôi có chứa NAA và BA ñều có kết quảñối với cả dưa chuột và bí xanh [34].
Năm 1974 Eun J. S. và cộng sự khi nuôi cấy bao phấn dưa chuột ñã phát hiện calus phát triển từ bao phấn sau khi nuôi cấy 7 ngày trên môi trường có bổ sung 2,4 D. Sau 30 ngày rễ và chồi sẽ xuất hiện[39].
Theo Lazarte, J. E và Sasser, C.C (1982) bao phấn dưa chuột ñược trên nuôi cấy môi trường Nitsch và Nitsch cải tiến sau ñó tạo callus trên môi trường cơ bản MS. Phôi phát triển thành cây con trên môi trường Nitsch and Nitsch ñặc có chứa 20 g/lit raffinos [42].
Khi nghiên cứu các yếu tốảnh hưởng ñến kết quả nuôi cấy bao phấn dưa chuột. Tác giả T.Suprunova và N.Shmykova ñã nuôi cấy 10 giống (Hiziz, Gordion, Hana, Melen, Kedet, Asak, Reisa, Tristan, Tarantutka và Rostovchanin).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………21 Kết quả chỉ có giống Gordion có thể tạo cây ñơn bội từ nuôi cấy bao phấn. Trong số những chất ñiều tiết sinh trưởng ñược nghiên cứu, thidiazuron (TDZ) là tốt nhất cho sự cảm ứng của bao phấn với nồng ñộ tối ưu nhất là 0,02 mg/l. Dựa vào kết quả nghiên cứu các tác giả khẳng ñịnh giai ñoạn phát triển tốt nhất của bao phấn
ñể tạo cây ñơn bội là tiểu bào tửñơn nhân muộn và sớm [52].
Năm 2002 H. G. Ashok Kumar và cộng sự ñã tiến hành thí nghiệm trên hai giống dưa chuột Calypso và Green Long cho thấy bao phấn dưa chuột của cả hai giống ñều thích hợp cho sự tái sinh phôi trực tiếp và tái sinh phôi gián tiếp thông qua quá trình tạo callus trên môi trường cơ bản B5có bổ sung 0,25M saccarose và 2µM 2,4D hoặc kết hợp 2µM 2,4D + BAP 1µM. Nụ hoa trước khi nuôi cấy ñựơc xử lý lạnh 4oC trong 2 ngày là mức xử lý lạnh tối ưu. Callus hình thành sau hai tuần nuôi cấy và có màu vàng. Callus sau khi hình thành ñược chuyển sang môi trường B5 muối và vitamin có chứa 0,09M saccarose + 0,05µM NAA + 0,05µM Ki. Sau ñó lại ñược chuyển sang môi trường ñể phát sinh phôi là môi trường B5 muối và vitamin có chứa 0,09M saccarose và 5µM ABA. Cuối cùng ñể phôi nảy mầm thành cây, callus lại
ñược chuyển sang môi trường cơ bản B5 + 0,09M saccarose + 0,25 µM NAA + 0,25 µM KN. Qua soi nhiễm sắc thể ở ñầu rễ của 24 cây tái sinh ở mỗi giống ñã phát hiện ñược 21 cây giống Calypso và 17 cây giống Green Long là
ñơn bội [19].
Tại Trung Quốc năm 2007 Song et al. cũng nghiên cứu 20 kiểu gen của cây dưa chuột chỉ có 16 kiểu gen tạo ñược callus. Tác giảñã khẳng ñịnh xử lý nụ hoa trước khi nuôi cấy là chìa khoá của sự thành công trong nuôi cấy bao phấn. Xử lý nhiệt phụ thuộc vào kiểu sinh thái, các loài dưa chuột từ vùng lạnh có phản ứng tốt khi xử lý sốc lạnh, các loài dưa chuột từ vùng nóng có phản ứng tốt khi xử lý sốc nhiệt. Môi trường tốt nhất cho sự phát sinh callus là môi trường MS có bổ sung 4,44M BA, 2,26M 2, 4-D, 4,64M KIN, 3%
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………22 sucrose và 0,8% agar. Môi trường cho sự phát sinh phôi là MS có bổ sung 0,54M NAA, 13,32M BA, 3% sucrose và 0,8% agar. Môi trường cho sự tái sinh cây là MS bổ sung 2,22M BA, 6% sucrose và 1,2% agar[ 38].