4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường dinh dưỡng cơ bản ñế n hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột
Nền môi trường dinh dưỡng cơ bản là yếu tố có tính quyết ñịnh rất lớn
ñến khả năng hình thành callus. Vì ñây là nơi cung cấp chất dinh dưỡng trong suốt quá trình phát sinh và phát triển của callus. Tuy nhiên, không phải tất cả
các loại cây trồng thậm chí cả kiểu gen ñều có phản ứng như nhau khi nuôi cấy trên cùng một môi trường dinh dưỡng cơ bản. Theo nghiên cứu của Xue và cộng sự năm 1989 [57] môi trường thích hợp cho nuôi cấy bao phấn dưa hấu là môi trường dinh dưỡng cơ bản MS, còn theo nghiên cứu của H. G. Ashok Kumar và cộng sự năm 2002 [19] thì môi trường thích hợp cho nuôi cấy bao phấn của 2 giống dưa chuột Calypso và Green Long lại là môi trường dinh dưỡng cơ bản B5. Như vậy, việc xác ñịnh môi trường dinh dưỡng cơ bản thích hợp cho sự hình thành callus từ nuôi cấy invitro bao phấn của 2 giống nghiên cứulà rất cần thiết. ðể xác ñịnh môi trường dinh dưỡng cơ bản thích hợp cho 2 giống dưa chuột nghiên cứu chúng tôi tiến hành cấy bao phấn của 2
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………36 giống dưa chuột ñược xử lý lạnh 4oC trong 48 giờ trên 3 môi trường cơ bản là MS, N6 và B5 có bổ sung 3% saccarose, 5g/l agar 2ppm 2,4D và 15% CW.
Các môi trường dinh dưỡng cơ bản khác nhau có ảnh hưởng khác nhau
ñến hiệu quả tạo callus. Theo dõi sự hình thành và phát triển callus chúng tôi thu ñược số liệu trình bày trong bảng 4.1, bảng 4.2 và hình 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng cơ bản ñến hiệu quả
tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột
Tỷ lệ bao phấn sống (%) Tỷ lệ bao phấn tạo callus (%) Tỷ lệ callus màu vàng (%) Môi trường
Marinda Valaspik Marinda Valaspik Marinda Valaspik MS 70,67 74,83 22,17 b 28,83 c 32,33 28,84
B5 25,33 22,67 13,83 a 13,17 b 20,00 27,81 N6 21,83 15,67 12,50 a 9,33 a 9,78 23,31
CV% 2,32 2,99
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng cơ bản
ñến ñộng thái tăng trưởng callus
ðường kính callus qua các tuần nuôi cấy (mm)
Marinda Valaspik Môi trường 3 tuần 4 tuần 5 tuần 6 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần 6 tuần MS 3,0 6,2 8,0 8,4 2,7 5,8 8,3 8,8 B5 3,4 4,9 5,7 7,1 2,5 5,2 6,1 7,3 N6 3,2 4,3 5,4 6,5 3,1 4,9 5,9 6,8
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………37 0 5 10 15 20 25 30 35 MS B5 N6 Môi trường T ỷ l ệ b a o p h ấ n t ạ o c a ll u s ( % ) Marinda Valaspik
Hình 4.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng cơ bản ñến tỷ lệ bao phấn tạo callus
Sau khi nuôi cấy ñược 2-3 ngày những bao phấn trương lên và xuất hiện những hình cầu nhỏ màu trắng là những bao phấn sống và bắt ñầu hình thành callus. Những bao phấn trương lên và chuyển dần sang màu nâu rồi màu ñen ñó là những bao phấn chết. Những callus có chất lượng tốt là những callus ñược tạo thành sớm và có màu.
Như vậy, môi trường khác nhau ñã ảnh hưởng ñến tỷ lệ bao phấn sống cũng như tỷ lệ tạo callus và chất lượng callus của hai giống dưa chuột nghiên cứu. Ở cả 3 môi trường bao phấn cả 2 giống ñều có khả năng sống và hình thành callus. Trên môi trường MS cho tỷ lệ bao phấn sống cao nhất ñạt 70,67% (Marinda) và 74,83% (Valaspik), trong khi ñó môi trường B5 có tỷ lệ
bao phấn sống chỉ ñạt 25,33% (Marinda) và 22,67% (Valaspik), môi trường N6 cho tỷ lệ bao phấn sống thấp nhất. Tuy nhiên, tỷ lệ bao phấn tạo callus các giống khác nhau phản ứng với môi trường khác nhau: Với giống Marinda tỷ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………38 trên môi trường N6 và B5 cho tỷ lệ bao phấn tạo callus lần lượt là 12,50% và 13,83%; Với giống Valaspik môi trường khác nhau có tỷ lệ bao phấn tạo callus khác nhau, tỷ lệ bao phấn tạo callus cao nhất trên môi trường MS ñạt 28,83%, môi trường B5 cho tỷ lệ bao phấn tạo callus ở mức trung bình và thấp nhất trên môi trường N6 chỉñạt 9,33%.
Qua theo dõi chúng tôi nhận thấy môi trường nuôi cấy không chỉ ảnh hưởng tới tỷ lệ bao phấn tạo callus mà còn ảnh hưởng ñến chất lượng callus. Tỷ lệ callus màu vàng cao nhất trên môi trường MS ñối với cả hai giống: Marinda ñạt 32,33% và Valaspik ñạt 28,84% và thấp nhất trên môi trường N6 lần lượt là 9,78% (Marinda) và 23,31% (Valaspik).
Sự tăng trưởng của callus là chỉ tiêu khá quan trọng trong nuôi cấy bao phấn callus tăng trưởng càng nhanh thời gian cấy chuyển tái sinh cây càng sớm khả năng tái sinh cây xanh càng cao vì những callus thường bị mất khả
năng phát sinh hình thái trong quá trình nuôi cấy. Trên cả 3 môi trường callus
ñều tạo và phát triển ñược. Tuy nhiên, các môi trường khác nhau có sự phát triển của callus khác nhau. Trên môi trường MS callus phát triển tốt nhất ñối với cả 2 giống, callus ñạt kích thước 8,0 mm (Marinda) và 8,3 mm (Valaspik) sau 5 tuần nuôi cấy. Như vậy, chỉ sau 5 tuần nuôi cấy chúng ta ñã thu ñược callus ñủ tiêu chuẩn ñể phục vụ cấy chuyển tái sinh cây ñơn bội ở môi trường MS. Trong khi kích thước của callus trên các môi trường N6 và B5 tăng trưởng chậm, sau 6 tuần nuôi cấy kích thước của callus mới ñạt chỉ 6,5 - 7,1 mm ñối với Marinda và 6,8 - 7,3 mm ñối với Valaspik. Với kích thước ñạt
ñược như vậy thì sau 6 tuần nuôi cấy chúng ta cũng không thu ñược callus ñủ
tiêu chuẩn tái sinh cây ở hai môi trường này.
Qua kết quả theo dõi và phân tích trên chúng tôi rút ra kết luận:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………39 phát sinh phát triển callus ñối với cả 2 giống. Khi nuôi cấy bao phấn trên môi trường MS cho tỷ lệ tạo callus cao, callus phát triển nhanh và có chất lượng tốt. Do ñó, chúng tôi chọn môi trường MS là môi trường cơ bản cho các thí nghiệm sau.
4.1.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ở 4oC ñến hiệu quả tạo callus bao phấn dưa chuột
ðối với phần lớn các loại cây trồng việc xử lý bao phấn trước khi nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn ñến kết quả nuôi cấy bao phấn. Theo nghiên cứu của H. G. Ashok Kumar và cộng sự năm 2002 trên hai giống dưa chuột Green Long và Calypso cho thấy mẫu hoa của trước khi nuôi cấy ñược xử lý lạnh ở
4oC trong 2 ngày có ảnh hưởng tốt ñối với nuôi cấy bao phấn dưa chuột [19]. Nhưng với cây bí (Cucurbita pepo) xử lý lạnh ở 4oC trong 4 ngày là mức xử
lý lạnh tối ưu (Metwally et al., 1998)[32]. Như vậy, việc xử lý lạnh hoặc xử lý nhiệt ñối với bao phấn hay cây cho bao phấn trước khi nuôi cấy không chỉ tác
ñộng trực tiếp ñối với sự hình thành callus mà còn tác ñộng gián tiếp ñến tỷ lệ
tái sinh cây. Nhiệt ñộ và thời gian xử lý tối thích phụ thuộc vào từng giống và loại cây trồng khác nhau. Do ñó, ñể tìm hiểu ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến kết quả nuôi cấy bao phấn của 2 giống dưa chuột nghiên cứu chúng tôi tiến hành xử lý lạnh bao phấn dưa chuột ở nhiệt ñộ 4oC trong các khoảng thời gian 0 giờ, 12giờ, 24 giờ, 36 giơ, 48 giờ và 60 giờ, nhằm tìm ra thời gian xử lý thích hợp cho việc tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn 2 giống nghiên cứu. Các bao phấn ñược nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm 1ppm BAP, 2ppm 2,4D, 5 g agar/l và 15% CW và 30% Saccarose.
Qua theo dõi khả năng phát sinh của callus ở các mức thời gian xử lý khác nhau chúng tôi thu ñược kết quả trình bày trong bảng 4.3 và hình 4.2.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………40
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột
Tỷ lệ bao phấn sống (%) Tỷ lệ bao phấn tạo callus (%) Tỷ lệ callus màu vàng (%) CTTN
Marinda Valaspik Marinda Valaspik Marinda Valaspik L0 74,33 67,50 7,17 a 6,83 a 25,58 13,79 L12 78,17 77,67 21,67 c 20,56 c 31,54 21,08 L24 82,50 81,17 37,50 e 33,83 e 49,78 41,87 L36 75,83 72,33 28,67 d 25,67 d 30,23 32,47 L48 65,33 62,50 21,83 c 19,17 c 29,01 28,70 L60 41,67 38,67 19,33 b 12,44 b 18,39 30,80 CV% 2,12 2,23 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 12 24 36 48 60 Thời gian xử lý lạnh (giờ) T ỷ l ệ b ao p h ấ n t ạ o ca llu s (% ) Marinda Valaspik
Hình 4.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến tỷ lệ bao phấn tạo callus
Khi bao phấn ñược xử lý lạnh tỷ lệ bao phấn tạo callus tăng từ 2,7 ñến 5,2 lần (Marinda) và từ 1,8 ñến 5 lần (Valaspik) so với ñối chứng. Các mức xử lý lạnh khác nhau có ảnh hưởng khác nhau ở mức có ý nghĩa 5% ñến hiệu
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………41 tạo callus (trừ mức xử lý 12 giờ và 48 giờ trên giống Marinda). Cụ thể: khi tăng thời gian xử lý lạnh từ 0 giờ ñến 24 giờ tỷ lệ bao phấn sống tăng từ
74,33% lên 82,50% ñối với Marinda, Valaspik tăng từ 67,50% lên 81,17% và tỷ lệ bao phấn tạo callus cũng tăng lên từ 7,17% ñến 37,50% ñối với Marinda, 4,83% ñến 33,83% ñối với Valaspik. Nhưng tiếp tục tăng thời gian xử lý lạnh từ 24 giờ ñến 60 giờ thì tỷ lệ bao phấn sống giảm nhanh, Marinda giảm từ
82,50% - 41,67%, Valaspik giảm từ 81,17% - 38,67%, ñồng thời tỷ lệ bao phấn tạo callus cũng giảm theo từ 37,50% - 19,33% ñối với Marinda và 33,83% - 12,44% ñối với Valaspik.
Ngoài ra, thời gian xử lý lạnh còn ảnh hưởng ñến chất lượng callus của cả hai giống nghiên cứu. Các mức thời gian xử lý khác nhau cho callus màu vàng chiếm tỷ lệ chỉ dao ñộng trong khoảng 18,39% - 31,54% ñối với Marinda và Valaspik thì dao ñộng trong khoảng 13,79% - 32,47% so với tổng số callus tạo thành. Tỷ lệ callus màu vàng của hai giống ñạt cao nhất ở mức xử lý 24 giờ: Marinda có tỷ lệ callus màu vàng chiếm 49,78% và Valaspik có tỷ lệ callus màu vàng chiếm 41,87% so với tổng số callus tạo thành.
Trong quá trình theo dõi thí nghiệm chúng tôi thấy thời gian xử lý lạnh cũng ảnh hưởng ñến thời gian bắt ñầu xuất hiện callus của cả hai giống nghiên cứu. Khi bao phấn ñược xử lý lạnh thời gian bắt ñầu xuất hiện callus muộn hơn so với ñối chứng nhưng thời gian tạo callus lại tập trung hơn, tỷ lệ
bao phấn tạo callus và callus phát triển ñồng ñều so với ñối chứng. Như vậy, có thể thấy thời gian xử lý lạnh có ảnh hưởng rất tốt ñến tỷ lệ bao phấn tạo callus và chất lượng callus. Tuy nhiên, thời gian xử lý lạnh kéo dài sẽ không tốt cho khả năng phát sinh cũng như sự sinh trưởng của callus ñối với cả 2 giống. Ở mức xử lý lạnh 60 giờ xuất hiện rất nhiều callus màu vàng xỉn và màu nâu. Những callus này sau khi cấy chuyển sang môi trường tái sinh cho tỷ lệ tái sinh rất thấp ña số callus bị hoá nâu hoặc bị thuỷ tinh hoá.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………42
ðể thấy ñược mức ñộ tăng trưởng của callus ở các mức thời gian xử lý lạnh chúng tôi tiến hành theo dõi ñộng thái tăng trưởng ñường kính và ñã thu
ñược kết quả trình bày dưới bảng 4.4 và hình 4.3.
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến ñộng thái tăng trưởng callus qua các thời ñiểm theo dõi
ðường kính callus qua các tuần nuôi cấy (mm)
Marinda Valaspik Thời gian XLL (giờ) 3 tuần 4 tuần 5 tuần 6 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần 6 tuần L0 3,5 6,7 7,8 8,7 3,3 6,5 7,6 8,8 L12 3,5 6,5 8,3 9,0 3,2 6,4 8,3 8,9 L24 3,3 6,3 8,5 9,5 3,0 6,2 8,7 9,5 L36 2,8 5,8 7,7 8,4 2,8 5,6 6,9 8,2 L48 2,8 4,8 7,6 8,2 2,5 5,0 7,8 8,0 L60 2,5 4,3 6,5 7,2 2,2 4,3 5,6 6,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3 tuần 4 tuần 5 tuần 6 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần 6 tuần Marinda Valaspik
Thời gian sau cấy (tuần)
ð ư ờ n g k ín h c a ll u s ( m m ) L0 L12 L24 L36 L48 L60
Hình 4.3. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến ñộng thái tăng trưởng của callus qua các thời ñiểm theo dõi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………43 Qua ñó cho thấy thời gian xử lý lạnh cho bao phấn trước khi nuôi cấy cũng có ảnh hưởng ñến ñộng thái tăng trưởng của callus. Ở những tuần ñầu sau cấy khi ñược xử lý lanh callus của bao phấn tăng trưởng chậm hơn so với
ñối chứng. Nhưng ñến tuần thứ 5 và 6 sự tăng trưởng của callus ở công thức xử lý 12 và 24 giờ lại tăng rất nhanh vượt ñối chứng. Như vậy, xử lý lạnh cho bao phấn dưa chuột là rất tốt cho sự tăng trưởng của callus. Khi tăng thời gian xử lý lạnh từ 12 lên 24 giờ ñường kính callus tăng từ 8,7 - 9,5 mm, tiếp tục tăng thời gian xử lý từ 36 ñến 60 giờ ñường kính callus giảm mạnh thấp hơn so với ñối chứng.
Từ các kết quả thu ñược và phân tích ở trên chúng tôi kết luận: Xử lý lạnh cho bao phấn dưa chuột trước khi nuôi cấy có ảnh hưởng rất tốt ñến sự
phát sinh phát triển của callus trên cả 2 giống nghiên cứu. Mức xử lý lạnh ở
4oC trong thời gian 24 giờ là thích hợp nhất, cho tỷ lệ bao phấn tạo callus ñạt 37,50% trong ñó 49,78% là callus có màu vàng (Marinda) và ñạt 33,83% trong ñó 41,87% là callus có màu vàng (Valaspik), sau cấy 5 tuần callus có thẻ ñem cấy chuyển tái sinh. Trong 2 giống nghiên cứu giống Marinda có hiệu quả cao hơn giống Valaspik.
4.1.3 Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột
ðối với kỹ thuật nuôi cấy bao phấn của tất cả các loại cây trồng việc xác ñịnh thời ñiểm lấy hoa, kích cỡ nụ hoa, giai ñoạn phát triển của bao phấn nuôi cấy có ảnh hưởng rất quan trọng ñến tỷ lệ tạo callus và tần số tái sinh cây
ñơn bội. Bao phấn càng già thì tỷ lệ tạo callus và tái sinh cây càng thấp, ñồng thời tỷ lệ cây bạch tạng tăng. ðể xác ñịnh ñược kích thước nụ hoa phù hợp cho nuôi cấy bao phấn của 2 giống dưa chuột nghiên cứu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nụ hoa ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy bao phấn dưa chuột. Chúng tôi tiến hành cấy bao phấn của 2 giống dưa
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………44 chuột với các kích cỡ khác nhau trên môi trường cơ bản là MS có bổ sung thêm 1ppm BAP, 2ppm 2,4D, 5g/l agar và 15% CW. Kết quả thí nghiệm ñược