3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
3.2.1Nghiên cứu kỹ thuật tạo callus từ nuôi cấy invitro bao phấn dưa chuột
Thí nghiệm ñược bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức ñược lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc 30 ñĩa petri và mỗi ñĩa cấy 20 bao phấn.
* Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường dinh dưỡng cơ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………27 CTTN Môi trường Ký hiệu
CT1 Môi trường Muashige Skoog (1962) MS CT2 Môi trường Chu và Cs (1975) N6 CT3 Môi trường Gamborg (1968) B5
Nụ hoa thu với các kích thước ñược xử lý lạnh ở 40C trong 48 giờ, cấy trên các môi trường cơ bản có bổ sung 1ppm BAP; 2ppm 2,4D; 15% CW; 5g agar/l. Sau thí nghiệm 1 tìm ra nền môi trường cơ bản tốt nhất ñể sử dụng cho các thí nghiệm tạo callus tiếp theo.
* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh nụ hoa ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột
CTTN Thời gian xử lý lạnh (giờ) Ký hiệu CT1 0 L0 CT2 12 L12 CT3 24 L24 CT4 36 L36 CT5 48 L48 CT6 60 L60
Sau thí nghiệm 2 tìm ra ñược thời gian xử lý lạnh thích hợp nhất ñể sử
dụng cho các thí nghiệm tạo callus tiếp theo.
* Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nụ hoa ñến hiệu quả
tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột
CTTN Kích thước nụ hoa
CT1 5 - 9 mm
CT2 10 - 15 mm CT3 16 - 20 mm
Nụ hoa thu với các kích thước khác nhau xử lý lạnh thích hợp nhất TN2, cấy trên các môi trường cơ bản có bổ sung 1ppm BAP; 2ppm 2,4D; 15% CW; 5g agar/l. Kích thước nụ hoa ñược ño theo chiều dài nụ hoa (từñế nụñến ñỉnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………28 nụ hoa). Sau thí nghiệm 3 xác ñịnh ñược kích thước nụ hoa thích hợp nhất cho sự tái callus ñể sử dụng cho các thí nghiệm tạo callus tiếp theo.
* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ auxin trong môi trường nuôi cấy ñến hiệu quả callus từ nuôi cấy invitro bao phấn dưa chuột
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành trên 3 nhóm chất auxin ñó là:
αNAA, IAA và 2,4D so sánh với ñối chứng không bổ sung auxin. Thí nghiệm
ñược bố trí như sau: CTTN Nồng ñộαNAA; IAA; 2,4D (ppm) Ký hiệu CT1 0 ðC CT2 0,5 0,5 ppm CT3 1,0 1,0 ppm CT4 1,5 1,5 ppm CT5 2,0 2,0 ppm CT6 2,5 2,5ppm CT7 3,0 3,0 ppm
Sau thí nghiệm 4 tìm ra ñược loại auxin và nồng ñộ auxin tốt nhất ñể sử
dụng cho thí nghiệm 5.
* Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh của tổ hợp auxin + cytokinin trong môi trường nuôi cấy ñến hiệu quả callus từ nuôi cấy invitro bao phấn dưa chuột
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng một loại auxin ở nồng ñộ thích hợp nhất trong thí nghiệm 4 kết hợp với Kinetin (KI) và Benzyl amino purine (BAP). Các công thức thí nghiệm ñều ñược bố trí như sau:
CTTN Nồng ñộ KI; BAP (ppm) Ký hiệu CT1 0,0 ðC CT2 0,5 0,5 ppm CT3 1,0 1,0 ppm CT4 1,5 1,5 ppm CT5 2,0 2,0 ppm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………29