8 HAU 020364 Nhị ưu 3 Cường Thịnh – Yên Kỳ – Yên Bái 9 HAU 020201 Nếp thơm Vĩnh Hồng – Bình Giang – Hải Dươ ng
3.8 Sử dụng marker phân tử ñể tìm gene mùi thơm
- Chuẩn bị dịch chiết ADN: 50mM Tris HCl pH=8, 0.25mM EDTA pH=8, 300mM NaCl, 1% SDS, nước vô trùng.
- Chuẩn bị dung dịch TE dùng ñể bảo quản ADN: 10mM Tris HCl pH=8,
1mMEDTA pH=8 và H2O.
- Quy trình tách chiết ADN: thu 2cm mẫu lá non vào buổi sáng, cắt nhỏ vào cối và nghiền với 400µl dịch chiết (50mM Tris-HCl pH8.0, 0.25mM EDTA, 300mM NaCl và 1% SDS) cho tới khi thành dịch màu xanh lá cây. Bổ sung 400µl dịch chiết vào cối rồi chuyển sang ống eppendorf. Thêm 700µl dung dịch phenol:chloroform:isoamyalcohol (25:24:1), ly tâm 5 phút ở tốc ñộ 13000 vòng/phút, 15-20OC, hút dịch ñồng nhất phía trên, cho thêm vào ñó 600µl phenol:chloroform:isoamyalcohol (25:24:1), ly tâm 5 phút 13000 vòng/phút. Thu dịch trên và tủa ADN bằng ethanol 99,9%, ly tâm 10 phút 12000 vòng/phút. Thu tủa và hoà trong TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0). Bảo quản ở 40C và sử dụng 1µl cho phân tích PCR.
- Vị trí mồi nhân gen mùi thơm:
Trong ñó ESP, EAP nhân cả vùng gen thơm, ESP & IFAP nhân gen lặn fgr: thơm, INSP & EAP nhân gen trội Fgr: không thơm.
- Trình tự mồi sử dụng trong nhân gen PCR: trình tự mồi ñược thiết kế dựa trên ñoạn ña hình theo công bố của Bradbury và cs (2005):
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………57
ESP: 5’-TTG TTT GGA GTC TGC TGA TG-3’,
IFAP 5’-CAT AGG AGC AGC TGA AAT ATA TACC-3’.
Theo ñó, giống lúa mang gen mùi thơm sẽ xuất hiện sản phẩm PCR ñoạn ADN kích thước 257 bp còn giống không mang gen thì không có băng ADN nhân bản PCR nào.
- Thành phần phản ứng PCR với thể tích mẫu 25µl gồm 0,2µl Tag ADN
Polymerase, 2,5µl Tag Buffer 10X, 2µl MgCL2 25mM, 0,5µl dNTP 10mM,
2,5µl Wx-R primer, 13,8µl nuclerase free water và 1µl ADN tổng số.
- Thiết lập chu kỳ hoạt ñộng: 900C trong 2 phút và 30 chu kỳ, 900C-30”, 620C-30”, 720C-30” và 720C trong 5 phút.
- ðiện di: sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel agarose 2% với hiệu ñiện thế 65V trong 45’. Bản gene ñược nhuộm với ethydium bromide trong 10 phút rồi chụp ảnh UV.