Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU
2.3.5. Xác định hoạt độ pectinase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5-dinitrosalicylic) [25] [50]
(acid 3,5-dinitrosalicylic) [25] [50]
Phương pháp so màu
Phương pháp so màu là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất. Phân tích bằng phương pháp này mất ít thới gian so với các phương pháp hóa học khác.
Nguyên tắc
Cho enzym tác dụng với cơ chất là pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic được hiện màu với thuốc thử DNS (acid dinitrosalicylic) và đem đo mật độ quang ở bước sóng 575nm.
Định nghĩa đơn vị hoạt tính
Một đơn vị họat tính pectinase là lượng enzym cần thiết để giải phóng một µmol acid D-galacturonic từ pectin trong một phút ở 370C, pH = 4,2.
Hóa chất
- Dung dịch đệm acetat 0,1 M, pH 4,2 (dung dịch đệm thí nghiệm) - Thuốc thử DNS:
+ Dung dịch A: hòa tan trong 300g muối Na-K tartrat kép vào 500ml nước cất.
+ Dung dịch B: hòa tan trong 10g acid 3,5-dinitrosalicylic vào trong 200ml dung dịch NaOH 2M. Thuốc thử DNS dùng cho phản ứng: trộn dung dịch với dung dịch B, thêm nước cất đủ 1 lít. Chỉ pha chế dung dịch thuốc thử trước khi sử dụng. Giữ trong chai nâu và tránh CO2.
- Dung dịch D-galacturonic chuẩn 100 µmol/ml.
- Dung dịch pectin 1%: đun nóng 100ml dung dịch đệm thí nghiệm. Trong khi đun và khuấy, cho từ
từ 1g pectin, đun và khuấy đến khi tan. Dung dịch trong và có dạng keo. Không đun sôi dung dịch. Làm lạnh và thêm nuớc cho đủ 100ml. Bảo quản ở 40C.
- Dung dịch enzym: hòa tan một lượng enzym nhất định trong dung dịch đệm và bảo quản trong ngăn
đá.
Cách tiến hành
Cho vào ống nghiệm :
- 0,5ml dung dịch pectin 1% pha trong đệm acetat 0,1M pH 4,2. - 0,5ml dung dịch enzym pha trong đệm acetat.
Lắc đều và ủở 370 trong 60 phút.
Thêm 3ml thuốc thử DNS, trộn đều và đun sôi chính xác trong 15 phút, sau đó làm lạnh nhanh trong bồn nước lạnh.
Thêm 1ml nước cất , lắc đều và đo mật độ quang ở bước sóng 575nm.
Đồng thời thực hiện mẫu thử không bằng cách thay 0,5ml dung dịch enzym bằng 0,5ml dung dịch
đệm acatat.
Dựng đường chuẩn
Xây dựng đường chuẩn với acid D-galacturonic chuẩn có nồng độ từ 0 đến 250mg/ml.
Bảng 2.1 : Xây dựng đường chuẩn với acid D-galacturonic (mg/ml).
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dd acid D-galacturonic 100 mg/ml 0 1 2 3 4 5
Dung dịch đệm(ml) 5 4 3 2 1 0
Nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml) 0 1 2 3 4 5 Vẽđồ thị biểu diễn mật độ quang(OD) theo nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml).
Tính kết quả
Hoạt độ của enzym pectinase được tính theo công thức sau với đơn vị quốc tế UI: HđPe = X.n (UI/g hay ml)
Trong đó:
X: lượng acid D-galacturonic được suy ra từđường chuẩn(mg/ml) m: khối lượng canh trường(g)
n: độ pha loãng
HđPe: hoạt độ enzym pectinase (UI/g)