3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2. Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp
Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp dựa theo tài liệu mô tả của Green (1991) và Vũ Triệu Mân (2003), có các bước sau:
Bước 1: Nghiền mẫu
- Tiến hành nghiền mẫu trong dung dịch ựệm Carbonate pH 9,6 với tỷ lệ 0,5 g lá/1 ml dung dịch ựệm.
- Nghiền mẫu ựối chứng dương
- Nhỏ vào mỗi giếng ELISA 100 ộl/giếng. Sau ựó ựể bản ELISA vào hộp ẩm và ủ qua một ựêm ở tủ lạnh thường.
Bước 2: Rửa bản ELISA
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 27
rửa vảy mạnh bản ELISA ựể loại hết nước ở trong bản ELISA) 3 lần bằng ựệm PBS Ờ T, mỗi lần cách nhau 3 Ờ 4 phút. Mỗi lần rửa bản ELISA ựều vảy mạnh ựể loại hết ựệm PBS Ờ T ra khỏi các giếng, sau ựó mới tiến hành nhỏ ựệm PBS Ờ T mới vào ựể rửa tiếp.
- Ủ bản ELISA ở 370C trong 45 phút.
Bước 3: Cố ựịnh kháng thể thỏ ựặc hiệu virus vào bản ELISA
- Nghiền lá cây khỏe trong dung dịch ựệm PBST Ờ PO với tỷ lệ 1 g lá/30 ml dung dịch ựệm PBST Ờ PO.
- Lọc lấy dịch cây khỏe, hòa kháng huyết thanh của virus PRSV với tỷ lệ 1/500.
- Nhỏ dịch cây khỏe + kháng huyết thanh của PRSV vào bản ELISA, mỗi giếng nhỏ 100 ộl.
- để bản ELISA trong hộp ẩm rồi ựem ủ ở 370C trong 2 giờ.
Bước 4: Hòa kháng thể ựơn dòng IgG (thỏ) của hãng Sigma với tỷ lệ 1/10000 trong ựệm PBST Ờ Ovanbumel.
- Rửa bản ELISA 3 lần bằng ựệm PBS Ờ T, mỗi lần cách nhau 2 phút. Bước 5: Cố ựịnh chất nền
- Hòa 2 viên chất nền của hãng Sigma vào 2 ml ựện cơ chất ựã pha, nhỏ 100 ộl/giếng.
Bước 6: đánh giá kết quả
để bản ELISA trong hộp ẩm, rồi ựể trong tối 2 giờ. Sau ựó ựánh giá kết quả bằng mắt thường và ựo trị số ELISA (OD) ở bước sóng 405 nm. Các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng (+). Giếng không có màu là cây không bị nhiễm bệnh. đọc kết quả tiếp bằng cách ựưa vào máy ựọc ELISA ở bước sóng 405 nm.