3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.3. Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR
3.4.3.1. Chiết DNA tổng số từ mô lá
DNA tổng số từ mô lá ựược chiết theo 2 phương pháp:
+ Phương pháp chiết nhanh nhanh bằng NaOH (Wang và cs, 1993): Cho khoảng 50 mg mô lá mẫu bệnh vào tube 1,5 mL, cho tiếp 500 ộl dung dịch NaOH 0,5 M vào tube 1,5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng ựể nghiền nhuyễn mẫu lá. Lấy 100 ộl dung dịch ựệm Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL, sau khi nghiền mẫu xong lấy 2 ộl dịch nghiền cho vào tube 1,5mL chứa dung dịch ựệm Tris 0,1M, pH = 8. Dịch hòa loãng này ựược dùng ựể chạy PCR.
+ Phương pháp chiết DNA bằng dung dịch ựệm CTAB theo mô tả của Doyle & Doyle (1987), Wang và cs ( 1993) như sau:
- Bước 1: Ủ ựệm CTAB + βME (100 ộl PME + 10 ml CTAB) ở 65oC trong 30 phút.
- Bước 2: Cho mẫu bệnh cần chẩn ựoán vào tube 1,5 mL theo tỷ lệ 0,1g/1ml ựệm CTAB + βME.
- Bước 3: Cho vào tube 500 ộl CTAB + βME. Nghiền nhỏ mẫu, lắc nhẹ. - Bước 4: Ủ tube trong ựiều kiện 60 - 65oC, trong khoảng 5 phút. - Bước 5: Ly tâm 7 phút.
- Bước 6: Lấy dịch trên tủa (khoảng 400 ộl).
- Bước 7: Chiết một thể tắch tương ựương (400 ộl) dung dịch Chlorofrom:isoanyl alcohol (24:1).
- Bước 8: Ly tâm trong 5 phút.
- Bước 9: Lấy dịch trên tủa (khoảng 300 ộl), ựể trong tủ lạnh -200C trong khoảng ắt nhất 2 phút.
- Bước 10: Chiết lần 2 với Chlorofrom: isoanyl alcohol (24 : 1). để lạnh 5 phút.
- Bước 11: Ly tâm trong 5 phút.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 29
- Bước 13: Bổ sung một thể tắch tương ựương (khoảng 200 ộl) isopropanol lạnh. để lạnh ở nhiệt ựộ -20oC trong 20 phút (ựến ựây là bước an toàn nên có thể ựể qua ựêm hôm sau làm tiếp). - Bước 14: Lắc ựều, ly tâm trong 15 phút.
- Bước 15: Loại bỏ dịch trên tủa, giữ lại cặn. Spin trong 15 giây ựể hút hết dịch trong tube ra.
- Bước 16: Rửa cặn DNA 2 lần với etol 70% (khoảng 700 ộl). - Bước 17: Làm khô cặn bằng không khắ.
- Bước 18: Hòa cặn DNA với 20 - 25 ộl TE, búng nhẹ ựể DNA tan hết, giữ tube ở ựiều kiện nhiệt ựộ - 20oC.
3.4.3.3. Tiến hành phản ứng PCR
* Chu trình phản ứng PCR kiểm tra DNA-A của begomovirus, sử dụng cặp mồi chung BegoARe và BegoAFor1 (Ha và cs, 2006):
H2O : 19,2 ộl BF Dream Taq : 2,5 ộl dNTPs : 0,5 ộl BegoA For 1 : 1 ộl BegoA Rev 1 : 1 ộl Dream Taq : 0,3 ộl DNA : 0,5ộl Tổng thể tắch : 25 ộl + Quy trình thực hiện phản ứng PCR: 94oC 4 phút x 1 94 oC 50 oC 72 oC 30 giây 35 giây 1 phút 35 giây x 35 72 oC 4 phút x 1 24oC 30 phút x 1
Bảng 3.1. Các mồi ựược sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự Mục ựắch 1 BegoAReV1 5Ỗ-ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*- 3Ỗ 2 BegoAFor1 5Ỗ-TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* - 3Ỗ Dùng ựể phát hiện DNA-A Begomovirus
3.4.3.3. Chạy ựiện di sản phẩm PCR và xem kết quả phản ứng
Chuẩn bị:
- Pha ựệm ựiện di TAE 1x từ dung dịch gốc (TAE 5x): Lấy 100ml TAE 5x cho vào cốc ựong, bổ sung thêm 400 ml nước cất, lắc ựều.
- Chuẩn bị bản gel: Cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung 100ml TAE 1x, sau ựó lắc nhẹ lọ ựể hoà tan agarose, sau khi agarose ựã tan hoàn toàn ựun trong lò vi sóng 3 Ờ 4 phút, bổ sung Ethidium Bromide theo tỷ lệ cứ 100 ml dung dịch gel cho 4ộl, lắc ựều, ựể lọ ở nhiệt ựộ phòng.
- Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 40oC thì ựổ vào khuôn có ựặt lược tạo lỗ khuôn. để khuôn ở nhiệt ựộ phòng.
- Lấy các tube 0,5mL ựã hấp khử trùng, ựánh số thứ tự. Cho vào mỗi tube 4 ộl Loading Dye X6, ựảo ựều và Spin trong 5 giây.
Tiến hành:
Sau 30 phút ựể khuôn ở nhiệt ựộ phòng thì tiến hành rút lược (cầm chắnh giữa lược, rút ựều tay ựể không vỡ giếng).
- đặt cả khay khuôn gel vào bể ựiện di, ựổ dung dịch ựệm TAE 1x phủ ngập gel.
- Nhỏ mẫu vào giếng: Dùng pipet hút 7 Ờ 10 ộl dung dịch mẫu cần chẩn ựoán cho vào mỗi giếng theo thứ tự. Ngoài các mẫu chạy PCR còn nhỏ thêm 1 giếng Marker làm chuẩn.
- Cắm nguồn ựiện cho máy ựiện di, ựặt ở hiệu ựiện thế 100V trong 25 - 30 phút, tắt máy ựiện di, ựặt bản gel ựược kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại, quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 31