NGHIÊN CỨU
3.1 đối tượng nghiên cứu
- Virus cúm A/H5N1 lưu hành ở các ựàn vịt, ngan nuôi tại huyện Quảng Xương, huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá, tỉnh Thanh Hóạ
- Virus cúm A/H5N1 lưu hành ở thuỷ cầm ựược buôn bán, giết mổ tại các chợ của huyện Quảng Xương, huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá, tỉnh Thanh Hoá.
3.2 Nội dung nghiên cứu
3.2.1 điều tra tình hình chăn nuôi thủy cầm tại huyện Quảng Xương, huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá, tỉnh Thanh Hóạ huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá, tỉnh Thanh Hóạ
3.2.2 điều tra các ổ dịch cúm gia cầm trên ựịa bàn tỉnh Thanh Hoá
3.2.3 điều tra tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm trên ựàn thủy cầm tại huyện Quảng Xương, huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá, huyện Quảng Xương, huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá, năm 2009 và ựợt II năm 2010.
3.2.4 Giám sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm trên ựàn thủy cầm tại huyện Quảng Xương, huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá, huyện Quảng Xương, huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá, tỉnh Thanh Hóạ
3.2.5 Giám sát huyết thanh học ựối với ựàn thủy cầm ựã tiêm vacxin H5N1 trên ựịa bàn nghiên cứụ trên ựịa bàn nghiên cứụ
3.3 Nguyên liệu
- Trứng gà có phôi 9 - 10 ngày tuổị
- Kháng nguyên chuẩn: Inactivated antigen H5N1 (Veterinary Laboratories Agency).
Thành phố Thanh Hoá, tỉnh Thanh Hóạ
- Dịch hầu họng và dịch ổ nhớp của vịt lấy tại huyện: Quảng Xương, huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá, thuộc dự án VAHIP trên ựịa bàn tỉnh Thanh Hóạ
- Các loại môi trường, hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị dùng trong phòng thắ nghiệm.
- Seringe, bông cồn, tăm bông, môi trường dùng trong lấy mẫụ
Hình 3.1. Kắt chiết tách ARN của Virut (Qiampviral RNA extract Kit) Kắt RT-PCR onestepQiagen
Hình 3.2. Kháng nguyên chuẩn Inactivated antigen H5N1 (Veterinary Laboratories Agency)
Hình 3.3. Máy Realtime PCR-BioRad (IQ5)
Serial: 575BR 1224 Nơi sản xuất: Mỹ Nguồn PAO
Ngày mua nhận: 16/11/2006
Hình 3.4. - Máy Realtime PCR Smartegcler
Serial: 400594
Noi sản xuất hãng Cepheid (Pháp) Nguồn FAO
Ngày mua nhận 19/5/2006
- Máy Realtime PCR Smartcycler Serial: 401530
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Sử dụng Phương pháp ựiều tra trực tiếp; Phương pháp hồi cứu
- Dựa vào báo cáo tổng hợp ựàn thuỷ cầm của huyện Quảng Xương, huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá, lưu tại Chi cục Thú y Thanh Hóa năm 2009 và ựợt II năm 2010 qua văn phòng dự án VAHIP tỉnh Thanh Hoá.
- điều tra các ổ dịch cúm gia cầm của huyện Quảng Xương, huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá trong năm 2009, 2010.
- điều tra kết quả tiêm phòng vacxin cúm gia cầm năm 2009 và ựợt II năm 2010.
3.4.2 Phương lấy mẫu và xử lý mẫu * Lấy mẫu ựể phân lập virus: * Lấy mẫu ựể phân lập virus:
Với thủy cầm sống, lấy dịch ngoáy hầu họng, dịch ngoáy ổ nhớp. Cách lấy:
+ Dịch ngoáy hầu họng: dùng tăm bông vô trùng cho vào miệng thủy cầm ngoáy quanh thành hầu họng, giữ vài giây rồi rút que ra từ từ theo ựường xoáy, cho ngay vào ống type ựựng môi trường bảo quản rồi ựậy kắn nắp.
+ Dịch ngoáy ổ nhớp: dùng tăm bông vô trùng cho sâu vào hậu môn thủy cầm, ngoáy quanh thành hậu môn rồi rút ra cho ngay vào ống type chứa dung dịch bảo quản, rồi ựậy kắn nắp.
+ Mẫu ựược giữ ở nhiệt ựộ 4oC và tiến hành phân lập virus trong vòng 48 giờ kể từ khi lấy mẫụ Nếu chưa phân lập ựược ngay thì bảo quản mẫu ở - 86oC.
* Xử lý mẫu bệnh phẩm.
Lấy mẫu bệnh phẩm từ trong tủ lạnh âm, làm tan băng. ép kĩ bông lên thành ống nhiều lần ựể vắt hết bệnh phẩm vào môi trường sau ựó bỏ bông ựị Cho vào bệnh phẩm một lượng kháng sinh: Penicillin, Streptomycin. để tủ lạnh ở 4oC trong thời gian ắt nhất 1 giờ. Ly tâm nhẹ 2000 vòng/ phút/ 5 phút, loại bỏ cặn, lấy dịch nổi phân lập virus.
* Lấy mẫu kiểm tra huyết thanh học.
Lấy máu của thuỷ cầm, chắt huyết thanh làm phản ứng huyết thanh học. Cách lấy máu: dùng Seringe lấy 2ml máu tĩnh mạch cánh của thuỷ cầm cho vào ống nghiệm nhỏ, ựặt nằm ngang cho máu ựông ra huyết thanh, chắt lấy huyết thanh cho vào Ampull rồi hàn kắn. Bảo quản huyết thanh ở nhiệt ựộ - 86oC trước khi ựem xét nghiệm.
3.4.3 Phương pháp phân lập virus trên phôi trứng gà
- Chọn trứng có phôi 9 - 10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 03 trứng/ mẫụ - Lau trứng bằng cồn 70% và ựục lỗ nhỏ phắa trên buồng hơị
- Dùng Seringe 1ml hút dịch bệnh phẩm (ựã xử lý ở trên) tiêm vào xoang niệu mô với lượng 0,2ml/ trứng.
- Gắn lỗ tiêm bằng parafin.
- Ấp trứng tiếp 5 ngày ở nhiệt ựộ 37oC.
- Theo dõi sau khi tiêm, soi trứng ngày 2 lần. Những trứng chết ựược cất ở 4oC. Sau thời gian ấp, trứng chết hoặc trứng sống cất vào tủ lạnh 4oC qua ựêm hoặc ắt nhất 4 giờ trước khi thu hoạch.
* Thu hoạch:
- Lau trứng bằng cồn 70% sát trùng vùng buồng hơi bằng cồn Iod 5%. - Dùng kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, bộc lộ xoang niệu mô. - Thu dịch niệu mô vào ống nghiệm, bảo quản ở - 86oC.
- Kiểm tra sự có mặt của virus gây ngưng kết hồng cầu bằng phản ứng HẠ - Giám ựịnh virus cúm gia cầm bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn serotype H.
3.4.4 Phương pháp tiến hành phản ứng Real time RT - PCR.
3.4.4.1 Nguyên liệu
- Mẫu thắ nghiệm: Mẫu Swabr ựược lấy theo hướng dẫn của chương
Quảng Xương, huyện Triệu Sơn và Thành phố Thanh Hoá tỉnh Thanh Hoá.
- Bảo quản mẫu: Sau khi ngoáy lấy dịch ở ổ nhớp, dịch hầu họng, que
ngoáy ựược bảo quản trong dung dịch ựệm BPS.