L êi cờm ển
3. NỘI DUNG NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨỤ
3.3.4. Phương pháp xác ựịnh hàm lượng hóa chất bảo vệ thực vật
Có nhiều phương pháp xác ựịnh hàm lượng HCBVTV như các phương pháp hóa học, phương pháp sinh học, phương pháp sắc ký... trong ựề tài nghiên cứu này chúng tôi sử dụng quy trình AOAC (The Association of Official Analytical Chemist) trên liên hiệp sắc ký khắ/ khối phổ (GC/MS)
3.3.4.1. Phương pháp sắc ký khắ (Gas Chromatography - GC)
ỘSắc kýỢ là thuật ngữ chỉ quá trình tách các chất ra khỏi một hỗn hợp chất nào ựó.
* Nguyên lý phương pháp:
Sắc ký khắ là quá trình tách các chất trong cột tách ở trạng thái khắ. Tuy nhiên, sắc ký khắ có thể tách ựược hỗn hợp các chất khắ, lỏng và rắn ựược hòa tan trong dung môi phù hợp và dễ dàng hóa hơi ở dưới 2500C khi ta bơm mẫu vào cột ở dạng lỏng. Vì vậy, sắc ký là phương pháp phổ biến và hiệu quả nhất ựã và ựang ựược áp dụng rộng rãi trên thế giớị
* Cơ sở tách của sắc ký khắ:
Quá trình tách trên sắc ký khắ là sự phân bổ của mẫu thử giữa 2 phạ Pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha ựộng là khắ thấm qua toàn bộ bề mặt tĩnh.
- Pha tĩnh là chất rắn (sắc ký khắ - rắn: Gas - Solid chromatography): chất rắn nhồi cột thường là các chất hoạt ựộng bề mặt như oxit silica, ngoài ra có thể dùng oxit nhôm hay polyetylens, quá trình hấp thu chủ yếu là hấp phụ.
- Pha tĩnh là chất lỏng (sắc ký khắ - lỏng (Gas - liquid chromatography) các chất lỏng bao bọc thành lớp màng mỏng trên bề mặt chất rắn trơ gọi là chất mang. Cơ sở của sự tách là sự phân bố của mẫu tách trong và ngoài lớp phim mỏng nàỵ
- Pha ựộng trong sắc ký khắ thường là các chất khắ ựơn hay hỗn hợp của 2 chất khắ. Các chất khắ thường ựược dùng là H2, N2, He, Ar tinh khiết ựạt ựến 99,9%. Chất khắ có này 2 nhiệm vụ là rửa giải chất phân tắch và mang chất
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ kinh tế nông nghiệp ... 40
phân tắch ra khỏi cột. Nói cách khác, chất khắ này mang mẫu vào cột ựể thực hiện quá trình tách. Nó chuyển ựộng (hay dẫn vào) liên tục trong suốt quá trình tách với tốc ựộ xác ựịnh. Vì thế, còn gọi là khắ mang của sắc ký khắ. Khi lựa chọn chất khắ nào làm khắ mang tùy thuộc vào:
- Bản chất của chất cần phân tắch.
- Loại Detector chọn ựể phát hiện chất phân tắch. - độ tinh khiết và yêu cầu tách.
- Kỹ thuật sắc ký khắ (T = const hay grandien).
- Khắ không ựược thay ựổi trạng thái lý hóa học khi ựi qua sắc ký khắ. Mẫu ựược phân tắch (gọi là chất tan) ựược tiếp xúc với hai pha tĩnh và ựộng. Quá trình sắc ký ựược mô tả sơ lược qua sơ ựồ sau:
Sơ ựồ 3.2. Sơ ựồ thu gọn của thiết bị sắc ký khắ
Trong ựó:
1. Bom khắ hay máy phát khắ 6. Detetor
2. Khóa an toàn 7. Bộ phận khuếch ựại tắn hiệu 3. Buồng hóa hơi 8. Bộ ghi
4. Buồng hấp phụ 9. Tắch phân kế có máy tắnh 5. Cột tách trong buồng ựiều nhiệt 10. Máy in
Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khắ là hệ thống cột tách (5) và Detector (6).
Nhờ khắ mang ựược chứa trong bom khắ (1). Mẫu từ buồng bay hơi ựược dẫn vào cột tách nằm trong buồng ựiều nhiệt (5), quá trình sắc ký xảy ra
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ kinh tế nông nghiệp ... 41
tại ựâỵ Sau khi các cấu tử dời bỏ cột tách ở các thời ựiểm khác nhau, cấu tử nào có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị giữ lại lâu hơn nên chúng ra khỏi hệ thống sắc ký muộn hơn, chúng lần lượt ựi vào Detector (6) tại ựây chúng ựược chuyển thành các tắn hiệu ựiện. Tắn hiệu này ựược khuếch ựại ở bộ phận khuếch ựại tắn hiệu (7) rồi chuyển sang bộ ghi (8) hoặc chuyển sang phân tắch kế có máy tắnh (9). Tại ựó các tắn hiệu ựược xử lý rồi chuyển sang bộ phận in kết quả (10), kết quả của sắc ký là sắc ựồ.
Trên sắc ựồ nhận ựược ở bộ ghi ta có các tắn hiệu ứng với các cấu tử ựược gọi là Pic (peak). Thời gian lưu của từng cấu tử là ựại lượng ựặc trưng (ựịnh tắnh) cho chất cần tách. Diện tắch Pic là thước ựo ựịnh lượng cho từng chất cần tách trong hỗn hợp cần nghiên cứụ
Trong kỹ thuật sắc ký khắ, quá trình Gradiene nhiệt ựộ là rất cần thiết vì quá trình này tạo ựiều kiện ựể các chất dễ dàng tách ra khỏi nhaụ
3.3.4.2. Phương pháp khối phổ khắ (Mass Spectrometer: MS)
Nguyên lý phương pháp: khi cho các phân tử dạng khắ va chạm với một dòng electron có ựộng năng lớn thì các phân tử khắ sẽ bật ra 1 hoặc 2 electron, chúng trở thành các ion có ựiện tắch +1 (chiếm tỷ lệ lớn) và ion có ựiện tắch +2. Các loại ion này ựược gọi là ion phân tử. Quá trình này ựược gọi là sự ion hóa các phân tử, nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lượng lớn thì nó sẽ phá vỡ tiếp thành những mảnh ion khác nhau, hiện tượng này gọi là quá trình phân mảnh. Năng lượng của quá trình phân mảnh vào khoảng 30 - 100 eV, cao hơn năng lượng ion hóa các phân tử (8 - 15 eV).
Nếu ion có khối lượng m và ựiện tắch e thì số m/e ựược gọi là số khối của ion ựó. Các ion này ựược cho ựi qua một ựiện trường ựể tăng tốc ựộ chuyển ựộng của chúng, sau ựó ựược dẫn qua một từ trường ống có cường ựộ H, chúng sẽ chuyển ựộng theo hình vòng cung có bán kắnh r khác nhau phụ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ kinh tế nông nghiệp ... 42
thuộc vào tỷ số m/ẹ Dựa vào nguyên tắc này người ta tách và nhận biết ựược sự có mặt của các ion bằng các phương pháp khác nhau theo số khối của chúng, gọi là phổ khối lượng (MS).
Các ion của phổ khối có thể là các nguyên tử, phân tử bị ion hóa hay các mảnh của phân tử một hợp chất mẫu cần phân tắch ựược sinh ra nhờ nguồn năng lượng phù hợp với các electron có ựộng năng lớn cắt phân tử thành các ion (nguồn tạo ion). Trong kỹ thuật phổ khối các ion ựược phân loại như sau:
- Ion ựồng vị: là các dạng ion ựồng vị của một nhân tố, trong tự nhiên nhiều nhân tố hóa học có 2, 3 hoặc 4 ựồng vị khối lượng khác nhaụ Do ựó, khi mất ựi một electron nó cũng tạo ra bằng ấy các ion ựồng vị của nguyên tố.
- Ion phân tử: là các ion có số khối bằng chắnh khối lượng của phân tử chất. Nó là các phân tử bị mất ựi 1 electron và có ký hiệu là M+ .
- Ion mảnh: là do ion phân tử hay một phân tử bị bắn mà sinh ra, các ion này có khối lượng nhỏ hơn khối lượng của phân tử chất.
Sự phân ly khối phổ dựa trên cơ sở khối lượng khác nhau của các mảnh ion dưới tác dụng của từ trường mạnh trong môi trường chân không, ion nào có khối lượng nhỏ sẽ bị lệch nhiềụ Chùm ion ựược phân ly sẽ quét qua khe ựo của máy ựể hướng vào bộ phận chọn lọc và phát hiện (Detector) ựể chuyển hoá thành tắn hiệu ựiện. Ứng với mỗi một Pic trên sắc ký ựồ người ta nhận ựược một khối phổ ựồ riêng biệt và hoàn chỉnh.
3.3.4.3. Liên hiệp sắc ký khắ/ khối phổ ký (GC/MS)
Vào những năm ựầu của thập kỷ 70, kỹ thuật liên hợp kắn giữa phương pháp sắc ký khắ và quang phổ khối lượng ra ựờị Trong kỹ thuật này người ta không cần phải thu nhận các cấu tử riêng biệt từ cột sắc ký khắ ựiều chế nữạ Các cấu tử ựược tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lượt ựược ựưa vào nguồn ion của máy khối phổ. Tại ựó chúng ựược phân mảnh và tách khối nhờ một từ trường
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ kinh tế nông nghiệp ... 43
rồi ựi vào bộ nhận quang ựiện ựể chuyển hóa thành tắn hiệu ựiện. Ứng với mỗi Pic trên sắc ựồ ta nhận ựược một khối phổ riêng biệt và hoàn chỉnh. Kỹ thuật ghép nối này ựược phát triển mạnh mẽ và ngày càng hoàn chỉnh.
Sở dĩ người ta có thể thực hiện ựược khá thuận lợi liên hợp GC/MS là vì cả 2 phương pháp này có chung những ựặc tắnh sau: mẫu ựược nghiên cứu ở trạng thái khắ, ựộ nhạy phát hiện cao, tốc ựộ phân tắch lớn và tương tự nhaụ đặc biệt trong sắc ký mao quản thì càng phù hợp.
Với việc sử dụng khối phổ ký là detector ựặc thù cho thiết bị sắc ký khắ, người ta thu ựược những thông tin hết sức quý giá trong việc xác ựịnh cấu trúc lạ ựặc biệt là khi không có chất chuẩn. Nhìn chung liên hợp GC/MS có những ưu ựiểm sau:
- Lượng mẫu nhỏ (ắt hơn 1ộg).
- Nghiên cứu ựược các chất không bền.
- Tiến hành tốt việc tách và nhận biết ựồng thời hỗn hợp nhiều cấu tử. Do có những ưu ựiểm chắnh xác, có khả năng phát hiện cấu trúc của các chất mới lạ nên nhiều nước và các tổ chức tiêu chuẩn thế giới ựã sử dụng phương pháp này dể xây dựng quy trình bắt buộc ựể xác ựịnh tồn lượng HCBVTV trong môi trường, nông sản và thực phẩm...
3.3.4.4. Phân tắch ựịnh lượng trong sắc ký khắ
Các thông tin thu ựược từ sắc ựồ có thể ựược ựánh giá cả về ựịnh tắnh lẫn ựịnh lượng. Tuy nhiên, mức ựộ chắnh xác và ựộ tin cậy của việc ựánh giá ựịnh lượng phụ thuộc vào thiết bị và phương pháp ựể chọn lọc. độ chắnh xác cao nhất (sai số 0,1 - 0,2%) chỉ có thể ựạt ựược với sự trợ giúp của các thiết bị ựiện tử thu nhận và xử lý tắn hiệu (tắch phân kế và máy vi tắnh).
3.3.5.5. Chế ựộ làm việc của GC/MS
1/ Bơm chắnh xác 1ộg dung dịch thu ựược vào máy sắc ký khắ ở ựiều kiện: - Cột HP- 5 dài 30 cm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ kinh tế nông nghiệp ... 44
- Nhiệt ựộ injector: 2500C - Nhiệt ựộ detector: 3000C - Flow: 4 ml/phút
- Spit: 1:1
2/ Chương trình nhiệt ựộ như sau: 800C: 1 phút 80 - 1600C: 100C/phút 160 - 2300C: 60C/phút 230 - 2800C: 5 phút 3/ độ chắnh xác của phương pháp
- Giới hạn phân tắch của máy ở ựiều kiện phân tắch ựã nêu 0,005 ng. - Giới hạn phát hiện của quy trình: 0,005 mg/kg (mg/ml).
3.3.4.6. Phương pháp tắnh kết quả
Hàm lượng các loại HCBVTV (X) ựược tắnh bằng mg/ml (ppm) hoặc mg/kg (ppm) theo công thức:
A . V . S2 . V2
X =
S1 . V1 . P Trong ựó:
A: Nồng ựộ chất chuẩn (mg/ml)
V: Thể tắch chất chuẩn bơm trong máy (ml) V1: Thể tắch mẫu bơm vào máy (ml)
V2: Thể tắch cuối cùng của mẫu phân tắch S1: Diện tắch Pic của mẫu chuẩn (mm2) S2: Diện tắch Pic của mẫu phân tắch (mm2)
P: Khối lượng mẫu (kg) hay thể tắch mẫu là nước (lắt)
3.3.4.7. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập ựược xử lý theo phương pháp thống kê sinh học và bằng phần mềm R - 2.11.1 (2010).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ kinh tế nông nghiệp ... 45