3. đỐI TƯỢN G NỘI DUN G PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1.Kiểm tra một số chỉ tiêu sinh học của giống virus vacxin trước khi ựưa vào sản xuất
ựưa vào sản xuất
3.5.1.1. Phương pháp xác ựịnh chỉ số ELD50 (Embryo lethal dose fifty percent)
- Chuẩn bị phôi gà: Phôi gà 9-10 ngày tuổi khỏe mạnh lấy từ ựàn gà bố mẹ sạch bệnh, ựánh dấu buồng hơi, ựánh dấu vị trắ ựầu phôi.
- Chuẩn bị virus vacxin: hai chủng virus vacxin nhược ựộc viêm gan vịt DH-EG-2000 và dịch tả vịt DP-EG-2000 ựược pha với nước sinh lý theo cơ số 10 nồng ựộ từ 10-1 ựến 10-6 hoặc 10-9. Xử lý kháng sinh ựể diệt tạp khuẩn.
- Cách tiến hành (tiến hành trong buồng cấy vô trùng): sát trùng toàn bộ vỏ trứng bằng cồn 700, sát trùng buồng hơi bằng cồn Iod 5%. Dùng dùi ựục trứng dùi một lỗ nhỏ ở ựỉnh buồng hơi. Mỗi nồng ựộ tiêm cho 5 phôi, liều tiêm 0,2 ml/phôi; vị trắ tiêm xoang niệu mô. Khi tiêm, ựưa kim qua lỗ dùi chếch về phắa ựầu phôi, sâu khoảng 1,5-2cm thì bơm từ từ 0,2 ml huyễn dịch ựã pha vào xoang niệu mô, hàn lỗ tiêm bằng parafin. Cho trứng vào tủ ấp tiếp ở 370C.
Riêng 5 phôi ựối chứng không tiêm virus.
- Theo dõi: Cứ 24h, 48h, 72h, 96h sau khi tiêm kiểm tra xem phôi còn sống hay ựã chết, loại bỏ những phôi chết trước 24h. Lấy các phôi chết cho vào tủ lạnh ở nhiệt ựộ 40C trong 12-24 giờ ựể mạch máu co lại tránh xuất huyết rồi mổ trứng thu nước trứng và kiểm tra bệnh tắch của phôi.
- Mổ trứng: sau 96 giờ ựem mổ tất cả trứng ở lô thắ nghiệm và lô ựối chứng ựể quan sát bệnh tắch của phôi.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 39 - Ghi số phôi chết có bệnh tắch và số phôi sống ở mỗi ựộ pha loãng.
Tắnh tỷ lệ phôi chết theo công thức:
Tổng số phôi chết Tỷ lệ phôi chết (%) =
Tổng số phôi chết + tổng số phôi sống x 100
- Tắnh toán liều gây chết tối thiểu 50% phôi (ELD50) theo công thức của Reed-Muench. LgELD50 = LgA + Xlgf A'-50 X = A'-B' Trong ựó: X: Khoảng cách tỷ lệ
A: độ pha loãng virus gây chết phôi cận trên 50% A': Tỷ lệ % chết phôi cận trên 50%
B': Tỷ lệ % chết phôi cận dưới 50% f: Bậc pha loãng virus (10-1)
- Tiến hành 5 ựợt thắ nghiệm như trên, tắnh chỉ số ELD50 trung bình.
3.5.1.2. Phương pháp xác ựịnh chỉ số EID50 (Embryo infective dose fifty percent).
- Chuẩn bị phôi trứng gà, giống virus vacxin, cách thức bố trắ thắ nghiệm và tiêm trứng, theo dõi giống như thắ nghiệm ựể xác ựịnh chỉ số ELD50 ở phần 3.5.1.1.
- Mổ trứng: ựem mổ tất cả trứng ở lô thắ nghiệm và lô ựối chứng ựể quan sát bệnh tắch của phôi.
- Ghi số phôi có bệnh tắch, không có bệnh tắch (so sánh với phôi ựối chứng) ở mỗi nồng ựộ pha loãng giống virus.
Bệnh tắch cần theo dõi ựể ựánh giá do nhiễm virus là: màng sưng dày, phôi xuất huyết, phù phôi, gan phôi xuất huyết.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 40 - Tắnh toán liều gây nhiễm tối thiểu 50% phôi (EID50) theo công thức của Reed-Muench.
3.5.1.3. Xác ựịnh chủng virus nhược ựộc dịch tả vịt DP-EG-2000 bằng phương pháp Realtime PCR
Chúng tôi sử dụng cặp mồi ựược thiết kế theo trình tự ựã ựược OIE cung cấp ựể thiết lập phản ứng Realtime PCR với thuốc nhuộm SYBR Green xác ựịnh virus nhược ựộc chủng DP-EG-2000 ựúng là virus dịch tả vịt.
3.5.1.4. Xác ựịnh chủng virus nhược ựộc viêm gan vịt DH-EG-2000 bằng phương pháp RT- PCR.
Chúng tôi tiến hành phản ứng RT- PCR, sử dụng hai ựoạn mồi DH3F và DH4R ựể xác ựịnh vùng gen VP1 của hệ gen virus viêm gan vịt. đoạn chứa gen VP1 và 2 ựoạn mồi có ựộ dài khoảng 800 bp. Sau ựó sản phẩm của phản ứng RT-PCR ựược ựiện di trên thạch agarose 1% ựể kiểm tra.