3. đỐI TƯỢN G NỘI DUN G PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.2.Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin DHP
3.5.2.1. Qui trình sản xuất hai loại vacxin ựơn giá Viêm gan vịt và Dịch tả vịt
Hai loại virus nhược ựộc DTV và VGV ựều thắch nghi trên phôi gà và có các chỉ số sinh học ổn ựịnh, do ựó chúng tôi tiến hành sản xuất hai loại vacxin ựơn giá này trên phôi gà tạo tiền ựề ựể sản xuất vacxin nhị giá.
Bước 1: Kiểm ựịnh và bảo quản giống
Trước khi ựưa vào sản xuất 1 tháng phải cấy chuyển virus vacxin qua phôi gà, các chỉ số ELD50, EID50 phải ổn ựịnh (ựộ lệch hiệu giá phải không quá 1/10). Kiểm tra tắnh ựặc hiệu của vacxin, giống virus vacxin phải ựảm bảo vô trùng, ựược giữ ở dạng nước trứng tươi và bảo quản ở nhiệt ựộ-860C.
Bước 2: Chuẩn bị trứng
Phôi gà 9-10 ngày tuổi ựược lấy từ ựàn gà bố mẹ sạch bệnh. Lựa chọn những trứng có phôi khỏe mạnh, ựánh dấu vị trắ buồng hơi và ựầu phôi, ựể cấy virus sản xuất vacxin.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 41
Bước 3: Cấy virus sản xuất vacxin - Pha dung dịch giống:
Sát trùng buồng cấy ắt nhất 3h bằng ựèn tử ngoại.
Pha giống virus vacxin với nước sinh lý ựã xử lý kháng sinh (cứ 1ml nước sinh lý cho 1mg streptomycine và 1000UI penicillin) thành nồng ựộ 10-2. Trộn ựều rồi ựể yên trong 30 phút ở 40C cho kháng sinh tác ựộng.
-Tiêm trứng và theo dõi:
Dùng dung dịch giống ựã pha tiêm vào xoang niệu mô của phôi. Khi tiêm ựưa kim qua lỗ ựã dùi chếch góc 450 sâu 1,5- 2cm, ựầu kim hướng về phắa ựầu phôi rồi bơm 0,2ml giống virus vào. Lấy parafin gắn kắn lỗ tiêm lại, ựể trứng nằm trên khay trứng và cho vào tủ ấm 370C ấp tiếp. Sau các khoảng thời gian 24h, 48h, 72h, 96h kiểm tra xem phôi trứng còn sống hay ựã chết. Loại bỏ những phôi chết trước 48h, chỉ thu những phôi chết và sống trong khoảng 48-96h, bảo quản trứng ở 40C trong 8-12h ựể mạch máu co lại và làm trong nước trứng.
Bước 4: Thu hoạch, xử lý và bảo quản vacxin.
Lấy trứng ra khỏi tủ lạnh, lau khô, sát trùng,mổ trứng bộc lộ xoang niệu, xoang dương mô rồi thu lấy nước trứng, dùng panh gắp phôi ra hộp lồng ựể ựánh giá vacxin sơ bộ thông qua bệnh tắch của phôi. Nước trứng ựược thu vào các bình cầu vô trùng. Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của bán thành phẩm.
Sau khi có hai loại vacxin ựơn giá viêm gan vịt và dịch tả vịt, nếu các chỉ tiêu kiểm tra ựạt yêu cầu thì chúng tôi tiến hành phối trộn ựể tạo vacxin nhị giá viêm gan vịt và dịch tả vịt theo tỷ lệ phù hợp sao cho trong một liều tiêm có tương ứng 1000EID50 cả hai loại virus vacxin nhược ựộc viêm gan vịt DH-EG-2000 và virus nhược ựộc dịch tả vịt DP-EG-2000 rồi ựóng vào các ampoul và bảo quản ở -200C.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 42 Giống gốc
Pha với nước sinh lý nồng ựộ 10-2
Kiểm tra vô trùng Giống sản xuất
Gây nhiễm phôi trứng gà 10 ngày tuổi
Ấp tiếp ở 370C/x giờ
Thu trứng ựể lạnh 40C/12giờ ựến 24 giờ
Mổ trứng
Thu chất chứa virus Kiểm tra vô trùng
Chuẩn ựộ hiệu giá Bán thành phẩm
Kiểm nghiệm vacxin
Ra chai, dán nhãn - bảo quản Ra chai, ựông khô- dán nhãn - bảo quản
Giống gốc
Pha với nước sinh lý thành nồng ựộ 10-2
Giống vacxin Kiểm tra vô trùng
Gây nhiễm phôi trứng
Ấp tiếp ở 37oC/96 giờ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thu trứng ựể lạnh 4oC/12 giờ
Mổ trứng
Thu chất chứa virus Bán thành phẩm Kiểm tra vô trùng
Chuẩn ựộ hiệu giá Kiểm nghiệm vacxin
Ra chai, dán nhãn, bảo quản Ra chai ựông khô, dán nhãn, bảo quản
Hình 1. Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin nhược ựộc dịch tả vịt, viêm gan vịt
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 43
3.5.2.2. Qui trình sản xuất vacxin DHP
- Sau khi có ựược 2 loại vacxin ựơn giá nhược ựộc DTV và VGV, tiến hành phối trộn trong phòng vô trùng theo tỷ lệ phù hợp (ựảm bảo trong 1 liều tiêm tương ứng có 1000 EID50 với cả 2 chủng virus vacxin trên)
- đóng vào ampoul với lượng 0,5 ml và bảo quản ở -200C.
3.5.2.2.1. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng
Vacxin sau khi ựược sản xuất sẽ ựược kiểm tra vô trùng trên các môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu, nước thịt gan yếm khắ, thạch nấm (Sabouraud). Mỗi lần kiểm tra, số lượng môi trường như sau.
- 4 ống môi trường nước thịt - 4 ống môi trường thạch thường - 4 ống môi trường thạch máu
- 4 ống môi trường nước thịt gan yếm khắ - 4 ống môi trường nấm
Ở mỗi lần, cho lần lượt 0,2ml vacxin vào từng ống chứa 15ml môi trường trên ựể kiểm tra, rồi cho vào tủ ấm 37oC/ 24-48h, lấy ra kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn.
* đọc kết quả:
- đến cuối quá trình theo dõi mà tất cả các ống môi trường ựều trong suốt, mầu sắc môi trường không ựổi, kết quả là âm tắnh, lô vacxin ựược coi là vô trùng.
- Nếu có một trong các ống môi trường có biểu hiện nhiễm trùng thì phải tiến hành nhuộm và soi kắnh ựể xác ựịnh loại vi khuẩn, ựồng thời kiểm tra lại lần 2 với số mẫu như trên. Nếu lần 2 âm tắnh thì mẫu ựược coi là âm tắnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 44 ựó ựược coi là dương tắnh. Lô vacxin có mẫu kiểm tra phải loại bỏ.
- Nếu lần 2 dương tắnh nhưng với loại tạp khuẩn khác thì phải tiến hành thêm lần 3 với cách thức như trên.
Riêng môi trường thạch nấm ựể ở nhiệt ựộ phòng 25-30oC từ 5-7 ngày mới kiểm tra xem nấm có mọc không. Vacxin phải ựảm bảo vô trùng và không có nấm.
3.5.2.2.2. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn
Sử dụng vịt ở lứa tuổi mẫn cảm, khỏe mạnh, không nằm trong ổ dịch, chưa tiêm phòng vacxin dịch tả vịt và viêm gan vịt. Tiến hành tiêm vacxin cho vịt với liều tiêm gấp 10 lần liều sử dụng (liều sử dụng 1000EID50). Sau khi tiêm theo dõi ựàn vịt trong 10 ngày. Vacxin ựược coi là an toàn nếu ựạt các yêu cầu sau: Con vật không có phản ứng phụ, không sốt hoặc chỉ số nhẹ, ăn uống hoạt ựộng bình thường.
- Trong phòng thắ nghiệm:
Tiến hành với 2 lô vịt con 3 ngày tuổi, mỗi lô 25 con, tiêm vacxin nhị giá dưới da hoặc bắp gấp 10 lần liều sử dụng; liều 0,5ml/con.
- Tại thực ựịa: bố trắ tiêm vacxin vừa sản xuất cho các ựàn vịt nuôi chưa ựược tiêm phòng vacxin dịch tả vịt và viêm gan vịt. Tiêm vacxin nhị giá dưới da hoặc bắp gấp 10 lần liều sử dụng, liều 0,5ml/con. Theo dõi các chỉ tiêu như trong phòng thắ nghiệm.
3.5.2.2.3. Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực và khả năng ựáp ứng miễn dịch của vacxin bằng phương pháp công cường ựộc
để kiểm tra hiệu lực của vacxin chúng tôi tiến hành phương pháp công cường ựộc. Việc công cường ựộc ựược tiến hành tại Phòng thắ nghiệm của Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, ựảm bảo nghiêm ngặt và an toàn sinh học. Dùng vịt 1 ngày tuổi khỏe mạnh chưa ựược tiêm phòng vacxin nuôi tại phòng thắ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 45 nghiệm bộ môn. Mỗi lô dùng 30 con: 20 con thắ nghiệm và 10 con ựối chứng.
- Lô thắ nghiệm: tiêm vacxin vào dưới da hoặc bắp liều 0,5ml/con (nồng ựộ virus vacxin tương ựương 1000EID50 với cả 2 chủng virus trên). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lô ựối chứng: không tiêm vacxin
Tiến hành công cường ựộc:
Sau 15 ngày dùng giống virus viêm gan vịt cường ựộc tiêm cho vịt con với liều 100 LD50/ml với lượng 0,5ml/con, theo dõi trong 15 ngày.
Sau 21 ngày, 60 ngày và 90 ngày tiêm vacxin dùng virus cường ựộc dịch tả vịt tiêm cho số vịt còn lại với liều 100 LD50/ml với lượng 0,5ml/con, mỗi ựợt tiêm theo dõi trong 15 ngày.
Số vịt sống sau khi công cường ựộc Tỷ lệ bảo hộ ( %) =
Tổng số vịt theo ựược công
x 100 Hiệu lực của vacxin ựược ựánh giá thông qua số vịt thắ nghiệm ựược bảo hộ với 2 loại bệnh trên.