4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1.2.Kết quả xác ựịnh chỉ số ELD50, EID50 của hai chủng virus viêm gan vịt và dịch tả vịt.
vịt và dịch tả vịt.
Bên cạnh việc kiểm tra khả năng thắch ứng của 2 chủng virus nhược ựộc viêm gan vịt và dịch tả vịt trên phôi gà, chúng tôi cũng tiến hành xác ựịnh 2 chỉ số ELD50 và EID50 trên phôi gà 9 ngày tuổi. Virus ựược pha loãng từ 10-
1
ựến 10-7 (ựối với chỉ số ELD50), pha loãng từ 10-1 ựến 10-10 (ựối với chỉ số EID50), mỗi ựộ pha loãng tiêm cho 5 phôi. Sau khi tiêm, theo dõi phôi ở các thời ựiểm từ 24 giờ ựến 96 giờ. Xác ựịnh tổng số phôi chết, phôi sống ở từng ựộ pha loãng. Tắnh tỷ lệ phôi chết theo công thức của Reed Muench.
4.1.2.1. Kết quả xác ựịnh chỉ số ELD50 của hai chủng virus viêm gan vịt và dịch tả vịt.
Chúng tôi tiến hành 5 ựợt thắ nghiệm, kết quả ựược trình bày ở bảng 4.5 và bảng 4.6
Bảng 4.5. Kết quả xác ựịnh chỉ số ELD50 của chủng virus vacxin nhược ựộc dịch tả vịt DP-EG-2000 Kết quả Lần thắ nghiệm Số phôi/1 nồng ựộ Liều tiêm (ml) ELD50 ELD 50 Tiêu chuẩn giống gốc 1 5 0,2 10-4,2 2 5 0,2 10-4,5 3 5 0,2 10-4,5 4 5 0,2 10-4,49 5 5 0,2 10-4 10-4,33 ELD50 = 10-4,33
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 53 Qua bảng 4.5 chúng tôi thấy chỉ số ELD50 của chủng virus dịch tả vịt DP-EG-2000 theo phương pháp Reed Muench như sau.
- Ở lần chuẩn ựộ thứ nhất, ELD50 của chủng ựạt 10-4,2/0,2 ml. - Ở lần chuẩn ựộ thứ hai, ELD50 của chủng ựạt 10-4,5/0,2 ml. - Ở lần chuẩn ựộ thứ ba, ELD50 của chủng ựạt 10-4,5/0,2 ml. - Ở lần chuẩn ựộ thứ tư, ELD50 của chủng ựạt 10-4,49/0,2 ml. - Ở lần chuẩn ựộ thứ năm, ELD50 của chủng ựạt 10-4,0/0,2 ml. Trung bình ở cả 5 lần chuẩn ựộ ELD 50 ựạt 10-4,33
. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Lê Văn Lãnh,1991 [21], virus vacxin nhược ựộc dịch tả vịt chủng Jansen khi nuôi cấy trên phôi gà có chỉ số ELD50 biến ựộng trong khoảng từ 10-4,2/0,2 ml ựến 10-4,5/0,2 ml.
Bảng 4.6. Kết quả xác ựịnh chỉ số ELD50 của chủng virus vacxin nhược ựộc viêm gan vịt DH-EG-2000.
Kết quả Lần thắ nghiệm Số phôi/1 nồng ựộ Liều tiêm (ml) ELD50 ELD50 Tiêu chuẩn giống gốc 1 5 0,2 10-5,22 2 5 0,2 10-5,31 3 5 0,2 10-5,33 4 5 0,2 10-5,4 5 5 0,2 10-5,26 10-5,30 ELD50 = 10-5,30
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 54 Qua bảng 4.6 chúng tôi thấy trung bình ở cả 5 lần chuẩn ựộ ELD 50 ựạt 10-5,3, chỉ số này phù hợp với tiêu chuẩn giống gốc
Như vậy chỉ số ELD50 của chủng virus viêm gan vịt DH-EG-2000 và dịch tả vịt DP-EG-2000 qua 5 lần thắ nghiệm tương ựối ổn ựịnh.
4.1.2.2. Kết quả xác ựịnh chỉ số EID50 của hai chủng virus viêm gan vịt và dịch tả vịt.
Song song với việc xác ựịnh liều gây chết 50% ựộng vật thắ nghiệm (ELD50) , chúng tôi cũng tiến hành xác ựịnh liều gây nhiễm 50% ựộng vật thắ nghiệm (EID50). đây cũng là chỉ tiêu ựánh giá ựược tắnh ổn ựịnh về ựộc lực của giống virus ựồng thời làm cơ sở cho việc tắnh liều gây virus trong cấy truyền ựể chế tạo vacxin. Kết quả ựược trình bày ở bảng 4.7 và 4.8.
Bảng 4.7. Kết quả xác ựịnh chỉ số EID50 của chủng virus vacxin nhược ựộc dịch tả vịt DP-EG-2000 Kết quả Lần thắ nghiệm Số phôi/1 nồng ựộ Liều tiêm (ml) EID50 EID50 Tiêu chuẩn giống gốc 1 5 0,2 10-5,22 2 5 0,2 10-5,38 3 5 0,2 10-5,4 4 5 0,2 10-5,17 5 5 0,2 10-5,31 10-5,29 EID50 = 10-5,29
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 55 Qua bảng 4.7 cho thấychỉ số EID50 qua các lần chuẩn ựộ là ổn ựịnh, biến ựộng từ 10-5,17/0,2 ml ựến 10-5,4/0,2 ml. EID50 trung bình của chủng 10-5,29/0,2 ml. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Bá Hiên và cs, 2006 [13].
Bảng 4.8. Kết quả xác ựịnh chỉ số EID50 của chủng virus vacxin viêm gan vịt DH- EG-2000 Kết quả Lần thắ nghiệm Số phôi/1 nồng ựộ Liều tiêm (ml) EID50 EID 50 Tiêu chuẩn giống gốc 1 5 0,2 10-8,17 2 5 0,2 10-7,78 3 5 0,2 10-7,84 4 5 0,2 10-7,67 5 5 0,2 10-7,84 10-7,86 EID50 = 10-7,87
Qua bảng 4.8 chúng tôi thấy chỉ số EID50 biến ựộng từ 10-7,84/0,2 ml ựến 10-
8,17
/0,2ml, EID50 trung bình là 10-7,86/0,2ml.
Như vậy, sau khi kiểm tra các ựặc tắnh sinh học của 2 chủng virus dịch tả vịt DP-EG-2000 và viêm gan vịt DH- EG-2000 chúng tôi thấy 2 chủng này hoàn toàn ựáp ứng ựược tiêu chuẩn của một chủng virus vacxin nhược ựộc dịch tả vịt. Có thể sử dụng chúng ựể sản xuất vacxin nhược ựộc phòng bệnh dịch tả vịt cho ựàn vịt ở Việt Nam.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 56
4.1.2.3. Xác ựịnh chủng virus nhược ựộc dịch tả vịt DP-EG-2000 bằng phương pháp Realtime PCR
để kiểm tra chắc chắn sự hiện diện của chủng virus Dịch tả vịt DP-EG- 2000 trong vacxin chúng tôi ựã sử dụng phương pháp Realtime PCR ựể kiểm tra.
Chúng tôi sử dụng cặp mồi ựược thiết kế theo trình tự ựã ựược OIE cung cấp ựể thiết lập phản ứng Realtime PCR với thuốc nhuộm SYBR Green xác ựịnh virus nhược ựộc chủng DP-EG-2000 ựúng là virus dịch tả vịt.
SYBR Green là thuốc nhuộm liên kết không ựặc hiệu với DNA mạch ựôi. SYBR Green chỉ phóng thắch một lượng nhờ tắn hiệu huỳnh quang khi nó ở dạng tự do trong dung dịch, nhưng tắn hiệu huỳnh quang sẽ tăng lên 1000 lần khi nó liên kết DNA mạch ựôi. Như vậy, tắn hiệu huỳnh quang tổng từ phản ứng sẽ tỷ lệ với lượng DNA mạch ựôi hiện diện, và gia tăng trình tự mục tiêu ựược khuếch ựại.
Phân tắch melt-curve ựược dùng ựể nhận diện các sản phẩm phản ứng khác nhau, bao gồm cả sản phẩm không ựặc hiệu. Sau khi phản ứng khuếch ựại hoàn tất, một phân tắch melt-curve ựược tiến hành bằng cách gia tăng nhiệt ựộ từng bước và kiểm soát tắn hiệu huỳnh quang tại mỗi bước. Khi DNA mạch ựôi trong phản ứng bị biến tắnh, tắn hiệu huỳnh quang sụt giảm. Sự sụt giảm tắn hiệu huỳnh quang này ựược biểu hiện trên ựồ thị. Tại nhiệt ựộ nóng chảy của sản phẩm khuếch ựại (Tm, nhiệt ựộ mà tại ựó 50% cặp base của một DNA mạch ựôi bị tách ra) xuất hiện một ựỉnh ựặc trưng phân biệt nó với sản phẩm khác như primer-dimer, vốn nóng chảy ở nhiệt ựộ khác.
Phản ứng Realtime PCR cho thấy tắn hiệu huỳnh quang (Fluorescence) của virus nhược ựộc dịch tả vịt DP-EG-2000 là 15,16 và nhiệt ựộ nóng chảy là 85,56. Kết quả chạy phản ứng Realtime PCR ựược thể hiện trên ảnh 3 và ảnh 4.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 57 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ảnh 4.4. Tắn hiệu huỳnh quang của chủng virus nhược ựộc DP-EG-2000 và ựối chứng dương
Ảnh 4.5. đường cong nóng chảy của chủng virus nhược ựộc DP-EG-2000 và ựối chứng dương
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 58 Kết quả của phản ứng ựược coi là dương tắnh khi xuất hiện tắn hiệu huỳnh quang có giá trị nhỏ hơn 35 và kèm theo là ựường cong nóng chảy của mẫu thể hiện nhiệt ựộ nóng chảy nằm trong khoảng từ 850C-860C. Kết quả chạy phản ứng Realtime PCR phù hợp với các chỉ tiêu trên. Như vậy, virus nhược ựộc chủng DP-EG-2000 chắnh là virus dịch tả vịt.
4.1.2.4. Xác ựịnh chủng virus nhược ựộc viêm gan vịt DH-EG-2000 bằng phương pháp RT- PCR.
Trong hệ gen của virus viêm gan vịt thì vùng gen ựược quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là gen mã hóa cho protein VP1. Vùng gen này bao gồm 714 nucleotit. Gen này ựược chứng minh là gen kháng nguyên, nó quyết ựịnh tắnh kháng nguyên và tắnh ựộc lực của virus. Những sai khác trong vùng gen này dễ dẫn ựến thay ựổi tắnh kháng nguyên và tắnh ựộc lực của virus viêm gan vịt.
Chúng tôi tiến hành phản ứng RT- PCR, sử dụng hai ựoạn mồi DH3F và DH4R ựể xác ựịnh vùng gen VP1 của hệ gen virus viêm gan vịt. đoạn chứa gen VP1 và 2 ựoạn mồi có ựộ dài khoảng 800 bp. Sau ựó sản phẩm của phản ứng RT- PCR ựược ựiện di trên thạch agarose 1% ựể kiểm tra. Kết quả chạy ựiện di ựược thể hiện trên ảnh 4.6.
Ảnh 4.6. Kết quả chạy ựiện di sản phẩm RT-PCR của mấu VxXT và VxAC trên thạch agarose 1%.
Ghi chú: M: chỉ thị phân tử AND của thực khuẩn thể Lamda. 1: sản phẩm RT-PCR của mẫu VxXT. 2: sản phẩm RT-PCR của mẫu VxAC.
800 bp
564bp 2 1 M
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 59 Qua ảnh 4.6 cho thấy, có xuất hiện một băng ADN rõ nét, khi so sánh với kắch thước các băng của chỉ thị phân tử chúng tôi nhận thấy băng này có kắch thước khoảng 800 bp tương ứng với kắch thước của sản phẩm RT-PCR dự kiến. Như vậy, có thể kết luận rằng chúng tôi ựã xác ựịnh ựược vùng gen VP1 của hệ gen virus viêm gan vịt, virus nhược ựộc chủng DH-EG-2000 chắnh là virus viêm gan vịt.