c. Kiểm tra hiệu lực
2.2.4.c tính chung của vi khuẩn Pasteurella multocida
2.2.4.1. ðặc điểm hình thái
Vi khuẩn Pasteurella multocida cĩ hình cầu trực khuẩn, bắt màu rõ ở hai đầu (lưỡng cực), gram âm, khơng di động, khơng hình thành nha bào, cĩ khả năng tạo giáp mơ. Kích thước vi khuẩn từ 0,6 - 2,5µm x 0,2 - 0,4 µm. Hình thái và kích thước của vi khuẩn cĩ thể thay đổi tuỳ thuộc vào các điều kiện nuơi cấy khác nhau (Rimler, 1992) [39]. Theo Smith (1959) [42] vi khuẩn phân lập từ lợn cĩ dạng trịn hơn, đường kính 0,8 - 1 µm. Trong máu động vật, hình thái của vi khuẩn thường đồng nhất, cịn khi phát triển trong mơi trường nhân tạo vi khuẩn thường đa hình thái (hình trứng, hình cầu, hình que). Khi nuơi cấy trong mơi trường cĩ cho thêm carbonhydrate, vi khuẩn
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ... 28
thường kết lại thành chuỗi dài (Rosenbusch và Merchant, 1939)[40].
P.multocida bắt màu lưỡng cực khi vi khuẩn ở trong tổ chức động vật hoặc trong mơi trường mới nuơi cấy, nếu nuơi cấy trong mơi trường nhân tạo thì ít thấy tính chất này. Manniger (1919) [33] giải thích tính lưỡng cực của vi khuẩn là do tế bào của vi khuẩn đang ở giai đoạn sinh sản. Trước khi phân chia, các tế bào phát triển trong cơ thể động vật hay trong mơi trường nuơi cấy, vi khuẩn tăng lên về kích thước, nguyên sinh chất tập trung về hai đầu tế bào nên khi nhuộm thấy dạng vi khuẩn lưỡng cực, phần thân tế bào bắt màu.
Dung quang của khuẩn lạc P.multocida là một đặc điểm cĩ thể dùng để đánh giá chủng vi khuẩn cĩ độc lực cao, thấp hay khơng cĩ độc lực. Trên mơi trường thạch huyết thanh, khuẩn lạc của vi khuẩn tạo ra các loại dung quang rất khác nhau. Vi khuẩn tạo khuẩn lạc cĩ dung quang sắc cầu vồng độc hơn so với vi khuẩn tạo khuẩn lạc cĩ dung quang sắc xanh (Namioka và Murata, 1961[36]).
2.2.4.2. ðặc tính nuơi cấy
Vi khuẩn P.multocida thuộc loại vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ tiện, chúng cĩ thể phát triển tốt trong hầu hết các loại mơi trường phổ thơng. Mơi trường dùng để nuơi cấy vi khuẩn P.multocida cĩ thể là mơi trường đặc, lỏng hoặc bán lỏng. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 370C, pH trong khoảng 7,2 - 7,4 (Nguyễn Như Thanh, 1997) [23].
Theo Carter (1952) [29] trong mơi trường Hottinger hoặc Martin, vi khuẩn P.multocida mọc tốt, làm đục mơi trường, tạo ra mùi tanh rất đặc trưng
Trong mơi trường nước thịt, sau 24 giờ nuơi cấy vi khuẩn làm đục mơi trường, khi lắc nhẹ cĩ vẩn đục như sương mù, vài ngày sau nước thịt trở lên trong, đáy cĩ cặn nhầy, lắc khĩ tan, trên mặt mơi trường cĩ lớp màng mỏng, khi lắc lớp màng này vỡ (Hồng ðạo Phấn, 1986) [14].
Trên mơi trường thạch thường vi khuẩn phát triển thành các dạng khuẩn lạc sau:
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ... 29
quang sắc cầu vồng, độc lực mạnh. Vi khuẩn cĩ dạng khuẩn lạc này thường tạo lớp giáp mơ nhiều hơn xù xì.
+ Dạng M (Muciod): Khuẩn lạc nhầy ướt, kích thước to nhất, dung quang sắc cầu vồng, độc lực yếu hơn dạng S.
+ Dạng R (Rough): Khuẩn lạc dẹt, rìa nhám, xù xì, dung quang màu xanh, dạng này độc lực yếu. ðộc lực của vi khuẩn giảm dần từ dạng S đến dạng R.
Trên mơi trường thạch máu vi khuẩn phát triển mạnh khơng làm dung huyết, khuẩn lạc hình trịn dạng S, kích thước lớn hơn trên thạch thường, màu tro nhạt và cĩ mùi tanh nước dãi khơ rất đặc trưng. ðặc điểm này rất dễ nhận ra và được nhiều tác giả cơng nhận như một đặc điểm để chẩn đốn.
Trên mơi trường thạch huyết thanh vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc đặc biệt cĩ hiện tượng phát dung quang khi qua sát vi khuẩn trên kính hiển vi độ phĩng đại 20 lần và gĩc chiếu phản quang của ánh đèn là 450. Màu sắc phát quang của khuẩn lạc phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn: vi khuẩn cĩ độc lực cao màu xanh lá mạ chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc, cịn 1/3 khuẩn lạc cĩ màu vàng cam, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent). Vi khuẩn cĩ độc lực trung bình thì diện tích khuẩn lạc cĩ màu xanh lá mạ ít hơn diện tích màu vàng da cam, khuẩn lạc này gọi là Fo (Orange Fluorescent), cịn vi khuẩn cĩ độc lực yếu, khuẩn lạc của chúng khơng cĩ hiện tượng phát quang, gọi là NF (Not Fluorescent). ðây là mơi trường đặc biệt dùng để phân lập giám định và xác định độc lực của vi khuẩn.
Cấy chuyển liên tục trong mơi trường nhân tạo cĩ thể làm thay đổi một số đặc tính sinh học của vi khuẩn. Vi khuẩn P.multocida phát triển tốt hơn trong mơi trường nhân tạo nếu cho thêm vào một số chất như cystein, glutamic acid, leucine, methionine, muối vơ cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine và đường (Michael và cộng sự, 2002) [34]. Trong mơi trường giàu
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ... 30
chất dinh dưỡng thì các gen liên quan tới quá trình trao đổi chất của vi khuẩn hoạt động rất mạnh (Michael và cộng sự, 2002) [34], Shivachandra và cộng sự, 2006) [ 41].
Theo tài liệu của OIE (2004) [37], Namioka và Mutara (1961) [35], mơi trường tốt nhất cho vi khuẩn P.multocida phát triển là mơi trường YPC (yeast extract peptone L-cystine) cĩ thêm sucrose và sodium sulfite (Na2SO4). Nuơi cấy trên mơi trường TSA (Tryptone Soya Agar) kích thước của khuẩn lạc sẽ lớn nhất.
Prince (1969) [38] cho rằng trên mơi trường YPC cĩ bổ xung thêm máu tính kháng nguyên của vi khuẩn tăng lên rõ rệt. ðây cũng là mơi trường giúp tái tạo giáp mơ của vi khuẩn. Vi khuẩn P.multocida cịn cĩ khả năng mọc tốt trong mơi trường chế từ đậu phụ. Tuy nhiên vi khuẩn P.multocida khơng phát triển trên mơi trường thạch MacConkey (Carter, 1984) [30].
ðể nuơi cấy vi khuẩn chế tạo vacxin người ta thường sử dụng mơi trường cơ bản cĩ thêm sucrose, peptone và chất chiết men bia. Mơi trường Hottinger cũng rất tốt cho vi khuẩn Pasteurella phát triển. Nuơi cấy cĩ sục khí cĩ thể làm tăng sinh khối vi khuẩn lên gấp 20 lần so với nuơi cấy tĩnh. Nuơi cấy động trên máy lắc, vi khuẩn cần 12 giờ để đạt tới pha dừng, cịn nuơi cấy trong fermentor bằng cơng nghệ lên men hiện đại cĩ sục khí và khuấy đảo liên tục chỉ cần khoảng 5 - 6 giờ đã đạt mức phát triển tối đa.
2.2.4.3. ðặc tính sinh hố
Phản ứng sinh hố cĩ tính đặc trưng cho mỗi giống, lồi vi khuẩn, vì vậy người ta thường sử dụng kết quả của phản ứng này để bước đầu giám định vi khuẩn cần nghiên cứu. Thơng thường, để kiểm tra phản ứng lên men các loại đường của vi khuẩn, các nhà nghiên cứu tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường cơ bản nước peptone 1% cĩ chứa loại đường yêu cầu thử nghiệm ở nồng độ dùng là 1%.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ... 31
galactose, glucose, mannose, sorbitol, xylose và sucrose. P.multocida cịn cĩ thể lên men mannit và mantose. Vi khuẩn P.multocida khơng làm tan chảy gelatin, khơng mọc trên mơi trường khoai tây, khơng làm đơng vĩn sữa.
Abdullahi M.Z. (1989) [28] kết luận tất cả các chủng vi khuẩn
P.multocida đều khơng gây dung huyết. Vi khuẩn cĩ khả năng sinh indol, tuy nhiên thời gian đọc kết quả tuỳ thuộc vào mơi trường sử dụng. Nếu dùng mơi trường 1% peptone thì vi khuẩn cho phản ứng dương tính sau 4 ngày nuơi cấy ở nhiệt độ 370C. Khi dùng mơi trường 2% peptone cĩ bổ sung thêm chất chiết men bia và một số vitamine, vi khuẩn P.multocida cho phản ứng indol dương tính chỉ sau 18 - 24 giờ nuơi cấy ở nhiệt độ 370C. Vi khuẩn P.multocida sẽ mất đặc tính sinh indol khi cấy chuyển nhiều lần trên mơi trường nhân tạo, nhưng sẽ cĩ lại đặc tính này khi tăng cường giống bằng cách tiêm cho động vật thí nghiệm. Một số chủng thuộc P.multocida khi bảo quản sau 2 năm cĩ thể khơng lên men xylose (De Alwis, 1992) [32].