3. NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1Phương pháp sản xuất vacxin áp dụng công nghệ lên men
3.5.1.1 Phương pháp chế tạo canh trùng
Giống vi khuẩn ñược nuôi cấy trên môi trường tăng sinh, sau ñó chuyển sang nuôi cấy trong fermentor dùng phương pháp lên men sục khí sẽ giúp tối ưu hóa các ñiều kiện nuôi cấy vi khuẩn như:
+ Nhiệt ñộ thích hợp 37± 0,50C. + Tốc ñộ khuấy 300 - 400 vòng/ phút. + Sục khí 30 - 40 lít/ phút.
+ Chỉnh pH nuôi cấy VK THT từ 7,2 - 7,4; nuôi cấy VK PTH từ 7,6 - 7,8. + Thời gian nuôi cấy 5,5 – 6 giờ.
3.5.1.2 Phương pháp kết hợp chất bổ trợ tạo vacxin
- ðối với vacxin thành phần (tụ huyết trùng lợn, phó thương hàn lợn): Canh trùng ñạt tiêu chuẩn (mật ñộ VK, an toàn ñộc tố, vô hoạt) ñược pha với nước muối sinh lý và hấp phụ keo phèn tỷ lệ 20% sao cho ñạt mật ñộ 10 ± 0,2 tỷ VK/ 1ml / 1 liều vacxin. Dùng máy khuấy từ trộn ñều 30 phút ñến một giờ.
- ðối với vacxin nhị giá tụ huyết trùng – phó thương hàn lợn: Tiến hành phối hợp hai loại canh trùng ñạt tiêu chuẩn trên và hấp phụ keo phèn tỷ lệ 20% sao cho mật ñộ vi khuẩn mỗi loại ñạt khoảng 10 ± 0,2 tỷ VK/ 1ml/ 1 liều vacxin nhị giá. Dùng máy khuấy từ trộn ñều khoảng 30 phút ñến một giờ.
3.5.1.3 Phương pháp chọn giống vi khuẩn
* Kiểm tra khuẩn lạc
Dùng que cấy bạch kim ria cấy trên ñĩa thạch máu hoặc thạch huyết thanh. Mục ñích là kiểm tra kích thước, hình thái khuẩn lạc. Sau 18 – 24 giờ khuẩn lạc của Salmonella choleraesuis trên thạch máu màu trắng ñục, tròn ñều, bóng láng, ñường kính 1-1,5mm. Khuẩn lạc của Pasteurella suiseptica
trên thạch huyết thanh khi soi dung quang màu xanh lơ ánh vàng, tròn ñều, bóng láng, ñường kính 1- 1,5 mm.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 42
*Kiểm tra vi khuẩn:
Nhuộm Gram ñể xem hình thái, màu sắc, kích thước vi khuẩn. Phương pháp nhuộm Gram gồm các bước sau:
1. Nhỏ dung dịch tím genxian lên tiêu bản: 1 – 2 phút. Rửa nước nhanh, vẩy khô.
2. Nhỏ dung dịch Lugol: ñể 1 phút. Rửa nước nhanh, vẩy khô.
3. Nhỏ cồn Axeton. Rửa nước thật nhanh.
4. Nhỏ dung dịch fuscin loãng : ñể 1 phút Rửa nước.
Thấm khô, sấy khô.
Xem kính:
Vi khuẩn Salmonella choleraesuis hình gậy ngắn, hai ñầu tròn, kích thước 0,4–0,6 x 1–3 µm, , bắt màu gram âm (màu ñỏ).
Vi khuẩn Pasteurella suiseptica có hình cầu trực khuẩn, bắt màu gram âm, kích thước vi khuẩn từ 0,6 - 2,5µm x 0,2 - 0,4 µm.
3.5.1.4 Phương pháp xác ñịnh số lượng vi khuẩn thường quy (ðếm số khuẩn lạc trên ñĩa thạch):
Pha loãng canh trùng với nước thịt thành các nồng ñộ khác nhau từ 10-1 ñến 10-8. Dùng 2 nồng ñộ 10-7, 10-8 , mỗi nồng ñộ dùng 3 ñĩa thạch máu (hoặc thạch huyết thanh), mỗi ñĩa ria 0,1ml ñều trên mặt thạch [22].
Cấy xong ñánh dấu từng ñĩa thạch (ñộ pha loãng, lô thí nghiệm…) và ñể ngửa trong phòng ấm 370C/24h. Sau 24 giờ ñem ra ñếm số khuẩn lạc mọc trên mặt thạch và tính toán.
Số lượng vi khuẩn trong 1 ml canh trùng ñược tính theo công thức dưới ñây: Số vi khuẩn trung bình
trong 1ml canh trùng = A x N x10
Trong ñó: A là số vi khuẩn có trong 0,1 ml canh trùng pha loãng. N là hệ số pha loãng của canh trùng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 43 --- Chọn giống --- ---TK, ñếm số--- ---TK, ñếm số--- ---Vô trùng----- Tiêm ñộng vật thí nghiệm--- ---Tính toán mật ñộ VK--- Hình 3.1. Qui trình tóm tắt sản xuất vacxin vô hoạt nhị giá THT – PTH Lợn Giống gốc VK Tụ huyết trùng lợn Giống gốc VK Phó Thương Hàn lợn Nuôi cấy tăng sinh Nuôi cấy tăng sinh
Nuôi cấy trong Fermentor Nuôi cấy trong Fermentor Diệt trùng Diệt trùng, lắc giải ñộc An toàn ñộc tố Thu hoạch canh trùng ñã vô hoạt Thu hoạch canh trùng ñã vô hoạt Phối hợp hai loại canh trùng, hấp phụ keo phèn Ra chai, dán nhãn, bảo quản Kiểm nghiVX ệm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 44 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});