3. đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨỤ
3.2.1Khả năng sinh trưởng của gà Ri và gà HỖMông
- Sinh trưởng tắch lũy từ sơ sinh ựến 14 tuần của gà Ri và gà HỖMông
3.2.2 Sức sản xuất thịt của gà HỖMông và gà Ri
- Khối lượng sống và tỷ lệ các phần thân thịt
3.2.3 Chất lượng thịt của gà HỖMông và gà Ri
- Chỉ tiêu chất lượng thịt (pH, màu săc, tỷ lệ mất nước và ựộ dai thịt) - Thành phần hoá học của thịt ựùi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 25
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm
3.3.1.1 Quy trình nuôi dưỡng và chăm sóc
Gà Ri và gà HỖMông ựược chăn nuôi theo phương thức công nghiệp; ựược chia thành 2 lô, cùng khẩu phần ăn, cùng ựiều kiện chăm sóc nuôi dưỡng, lịch sử dụng vaccinẹ (ghi rõ trong phần phụ lục)
Bảng 3.1 Bảng tiêu chuẩn khẩu phần ăn ựối với ựàn thắ nghiệm
Chỉ tiêu 0 - 4 tuần tuổi
5 - 8 tuần
tuổi > 8 tuần tuổi
- N. lượng trao ựổi (Kcal/kg) 2.900 3.000 3.000
- Protein (%) 19 17 15 - 16
- Xơ (%) 4 5 6
- Can xi (%) 0,9 - 1,0 0,9 - 1,0 1,1 - 1,2
- Phot pho (%) 0,75 0,70 0,70
- Muối ăn (%) 0,3 - 0,5 0,3 - 0,5 0,3 - 0,5
3.3.1.2 Thời ựiểm giết mổ và dung lượng mẫu của các chỉ tiêu theo dõi
- Tuổi giết thịt 14 tuần tuổi
Bảng 3.2 Dung lượng mẫu của các chỉ tiêu theo dõi
Giống gà
Dung lượng mẫu
Chỉ tiêu Gà HỖMông Gà Ri
Sức sản xuất thịt 10 10
Các chỉ tiêu chất lượng thịt 10 10
Các chỉ tiêu hóa học 10 10
Gen quy ựịnh chất lượng thịt 14 7
3.3.2 Các chỉ tiêu và phương pháp xác ựịnh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2.1 Sinh trưởng tắch lũy
Gà ựược cân vào một buổi sáng nhất ựịnh trước khi cho ăn. Gà mới nở ựược cân bằng cân ựiện tử có ựộ chắnh xác 0,01g. Gà 1 ựến 2 tuần tuổi ựược
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 26 cân bằn cân ựồng hồ có ựộ chắnh xác ổ 1g, các giai ựoạn sau ựược cân bằng cân ựồng hồ có ựộ chắnh xác ổ 5g.
3.3.2.2 Sức sản xuất thịt
Mổ khảo sát (10 con/giống) ựể ựánh giá năng suất và tỷ lệ các phần thân thịt:
- Khối lượng sống (g): khối lượng sau ăn 12 giờ
- Khối lượng thân thịt (g): là khối lượng gà sau cắt tiết, vặt lông, bỏ ựầu chân và các bộ phận phụ (cơ quan tiêu hoá, sinh dục).
Khối lượng thân thịt Tỷ lệ thân thịt (%) =
Khối lượng sống (g) x 100
- Khối lượng thịt ựùi (g): là khối lượng ựùi trái bỏ da, xương nhân ựôị Khối lượng thịt ựùi (g)
Tỷ lệ thịt ựùi (%) =
Khối lượng thân thịt (g) x 100
- Khối lượng thịt lườn (g): là khối lượng lườn trái bỏ da, xương nhân ựôị Khối lượng thịt lườn (g)
Tỷ lệ thịt lườn (%) =
Khối lượng thân thịt (g) x 100
3.3.2.3 Chất lượng thịt gà
Phương pháp phân tắch các chỉ tiêu chất lượng thịt
Lấy mẫu thịt, phân tắch các chỉ tiêu chất lượng thịt gà tại Phòng thắ nghiệm Bộ môn Di truyền Ờ Giống vật nuôi, Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nộị Các chỉ tiêu:
+ độ pH tại các thời ựiểm 15 phút và 24 giờ sau khi giết mổ trên mẫu cơ ngực ựược bảo quản tại phòng thắ nghiệm. Cắm trực tiếp ựầu ựo pH thịt Electrode (Mettler Toledo MP220 pH Metter) vào cơ ngực trái ựể xác ựịnh giá trị pH tại thời ựiểm 15 phút (pH15) sau khi giết thịt và tại thời ựiểm 24 giờ (pH24) bảo quản trong nhiệt ựộ 2-40C ở cơ ngực phảị Mỗi lần ựo lặp lại 5 lần tại từng thời ựiểm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 27 + đo màu sắc thịt (L: màu sáng, a: màu ựỏ, b: màu vàng) tại thời ựiểm 24 giờ sau khi giết mổ trên cơ ngực với 5 lần lặp lại ở từng thời ựiểm, bằng máy ựo Nippon Denshoker Handy Colorimeter NR 3000 Ờ Nhật Bản.
+ Hao hụt sau khi bảo quản: Tỷ lệ mất nước sau 24 giờ bảo quản (%). Lấy khoảng 50g mẫu thịt lườn và thịt ựùi ựược bảo quản trong túi nhựa kắn ở 2- 40C trong vòng 24 giờ. Cân mẫu trước và sau bảo quản ựể tắnh tỷ lệ mất nước.
+ Hao hụt khối lượng thịt gà sau khi chế biến: áp dụng theo phương pháp của Bognar (1987). Cân 30g mẫu có ựộ dày < 8mm ựem ựun ựến 750C trong vòng 10 phút. Tất cả các mẫu trước khi nấu ựều phải cho vào túi nhựa PE, sau khi nấu xong lấy túi ra ựể nguội bằng nghiệt ựộ trong phòng trong vòng 1 giờ và lấy mẫu ra khỏi túi, thấm khô và cân lại xác ựịnh tỷ lệ hao hụt.
+ độ dai của thịt gà ựược xác ựịnh bằng lực cắt tối ựa ựối với cơ thăn sau khi hấp cách thuỷ. Mẫu cơ sau khi hấp cách thuỷ ựược làm nguội và dùng ống thép có ựường kắnh bằng 1,25cm ựể khoan 5 ựến 10 thỏị Lực cắt ựược xác ựịnh trên các thỏi bằng máy Warner Bratzler 2000 (Mỹ) với số lần lặp lại là 5-10 lần.
Phương pháp phân tắch các chỉ tiêu hoá học của thịt ựùi
Lấy mẫu, phân tắch thành phần hoá học của thịt ựùi tại Phòng phân tắch Ờ Viện Chăn nuôị Các chỉ tiêu phân tắch:
+ Phương pháp xác ựịnh hàm lượng nước tổng số: theo tiêu chuẩn
Việt Nam (TCVN) - 4326-86.
Tiến hành: Sấy khô chén ở nhiệt ựộ 1000 C, ựể nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng chén (S). Lấy khoảng 5g thịt, cho vào chén cân ựã sấy khô, cân trọng lượng chén với mẫu (S1) trước khi cho vào sấỵ Cho chén với mẫu vào tủ sấy, sấy ở nhiệt ựộ 100-105oC trong khoảng 24 giờ, ựể nguội trong bình hút ẩm ựến nhiệt ựộ phòng, cân ựến trọng lượng mẫu không ựối chén với mẫu (S2) (Sai số cho phép giữa hai lần cân lặp lại trên cùng một mẫu thử không ựược vượt quá 0,2% trị số trung bình)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 28 (S1 - S2) Trọng lượng nước
độ ẩm (%) = --- x 100 = --- x 100 (1) S1 - S Trọng lượng mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chén, cân phân tắch với ựộ chắnh xác 10-4 g, bình hút ẩm, tủ sấỵ
+ Xác ựịnh hàm lượng khoáng tổng số ựược tiến hành theo TCVN 4327 Ờ 86
Tiến hành: Cân 5 g mẫu thịt cho vào chén nung, chén ựã sấy khô, cân trọng lượng D1, ựốt lên bếp ựiện ựến khi không còn khói ựen, ựưa chén có chứa mẫu vào lò nung, nung ở nhiệt ựộ 550oC trong vòng 6 giờ. Nếu mẫu thuộc loại nấm men, bột xương, vỏ sò thì phải nung ở nhiệt ựộ 600-650 oC trong vòng 6 giờ. Sau khi nung, ựưa mẫu ra sấy ở nhiệt ựộ 100 oC trong vòng 1 giờ, cân trọng lượng (mẫu + chén) (D2).
Khoáng tổng số (%) = D2 - D1 x 100 (2) Pg
Trong ựó: Pg: Trọng lượng mẫu phân tắch
D2: Trọng lượng chén + mẫu sau khi nung ở nhiệt ựộ 550 oC D1: Trọng lượng chén ựã sấy ở nhiệt ựộ 100oC.
+ Xác ựịnh hàm lượng lipit ựược tiến hành theo (TCVN-4331 - 2001).
Tiến hành: Cân từ 1 g mẫu thịt (Pg) khô, nghiền nhỏ cho vào ống giấy ựã sấy khô ở nhiệt ựộ 100 oC ống giấy vào bình chiết của hệ thống Soctex trong vòng 1,5 giờ. Lấy cốc mẫu ra, sấy khô ở nhiệt ựộ 100oC 30 phút, ựể nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng (M2).
M1 - M2 Lipit (mỡ) thô (%) = --- x 100 (4) Pg Trong ựó: M1: Trọng lượng cốc và mỡ M2: Trọng lượng cốc Pg: Trọng lượng mẫu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 29 * Hàm lượng protein thô: Sử dụng phương pháp J.Keildahl. Xác ựịnh hàm lượng N trong mẫu và nhân với hệ số hiệu chỉnh là 6,25 (Vì N chiếm 16% trong ựạm).
3.3.2.4 Gen quy ựịnh năng suất và chất lượng thịt
để xác ựịnh gen quy ựịnh năng suất và chất lượng thịt, mẫu máu (100 mẫu/1 giống) của gà Ri và gà HỖMông ựược lấy và bảo quản ựưa về phòng thắ nghiệm.
Phương pháp lấy mẫu
Chuẩn bị ống lấy mẫu: Các ống lấy mẫu có thể là ống eppendorf 1,5 hoặc 2ml có nắp kắn. Cho vào mỗi ống 50ộl dung dịch EDTA 0,5M.
Lấy mẫu: Chọn các cá thể gà ựại diện cho từng giống. Các cá thể lấy mẫu không có họ hàng thân thuộc với nhau và ựươc chụp ảnh từng con. Sử dụng loại kim và ống lấy mẫu chuyên dụng, các mẫu máu ựược lấy từ tĩnh mạch cánh của gà và mỗi con gà lấy khoảng 1ml máụ Sau khi lấy ựược mẫu máu, chuyển ngay mẫu vào ống có chứa dung dịch EDTA 0,5M, lắc nhẹ, ựềụ Sau ựó chuyển mẫu vào hộp lạnh ựể bảo quản ở 40C và chuyển về phòng thắ nghiệm bảo quản ở -200C.
Tách chiết và tinh sạch DNA từ các mẫu của các giống gà
+ Tách chiết DNA
Nguyên tắc chung: Màng tế bào ựược phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài nhân ựược giải phóng cùng với các protein. Sau ựó DNA ựược tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol. Cuối cùng, DNA ựược tủa bằng cồn 100% cùng với CH3COONa 3M, pH 5, 2 và thu lại bằng phương pháp ly tâm.
Các mẫu máu sau xử lý ựược tách chiết bằng Kit Quiagen.
Các bước tiến hành:
- Lấy 50ộl máu gà (ựã loại bỏ huyết tương và huyết thanh) và 150 ộl dung dịch ựệm TE cho vào ống eppendorf 1,5ml. Bổ sung 20ộl protein K và 200ộl ựệm AL. Lắc ựều khoảng 15 giây và ủ ở 560C trong 10 phút.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 30 - Bổ sung 200ộl cồn tuyệt ựối (96-100%) vào ống mẫụ Lắc ựều, sau ựó ly tâm nhẹ ựể các dung dịch trên thành ống xuống hết.
- Dùng Pipet hút hết dung dịch trong ống mẫu cho vào cột lọc (Dneasy Mini spin column) ựặt trong ống 2ml. Ly tâm 8000 vòng trong 1 phút sau ựó chuyển cột lọc sang một ống mớị
- Bổ sung 500ộl ựệm AW 1, ly tâm 8000 vòng trong 1 phút. Chuyển cột lọc sang ống mớị
- Bổ sung 500ộl ựệm AW 2, ly tâm 14000 vòng trong 3 phút. Chuyển cột lọc sang ống 1,5ml mớị
- Bổ sung 200 ộl ựệm TẸ Giữ ở nhiệt ựộ phòng trong 3 phút. Sau ựó ly tâm 8000 vòng trong 1. Bỏ cột lọc giữ lại ống có dung dịch chứa DNẠ Bảo quản DNA trong tủ -200C.
+ Kĩ thuật ựiện di DNA trên gel agarose Quy trình kỹ thuật:
- Chuẩn bị gel agarose: Cân 0, 8 g agarose vào 100 ml dung dich ựệm TAẸ đun trong lò vi sóng cho ựến khi thu ựược dung dịch trong suốt. để nguội ựến khoảng 50 - 60ỨC, ựổ dung dịch agarose vào khay ựã cài sẵn răng lược. Sau một thời gian gel ựông lại thì rút răng lược ra và ựặt bản gel vào bể ựiện di có chứa dung dịch ựệm TAẸ
- Tra mẫu DNA: Trộn một lượng mẫu thắch hợp với ựệm tra mẫu, tra vào các giếng trên bản gel. điện di với dòng ựiện một chiều có hiệu ựiện thế 100V, dòng 60 - 80 mA trong khoảng 30 phút.
- Sau khi kết thúc ựiện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng ựộ 0,5 ộl/ ml. Lấy bản gel ra sau 10 -15 phút và rửa trong nước sạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio -Rad.
đánh giá chất lượng DNA
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 31 - để xác ựịnh ựộ tinh sạch và nồng ựộ của DNA, ta tắnh chỉ số OD của DNA ở bước sóng 260nm và 280nm, sau ựó tắnh tỷ số giữa hai chỉ số OD ựó.
+ Nồng ựộ của dung dịch axit nucleic ựược xác ựịnh bằng cách ựo ựộ hấp thụ tại bước sóng 260 nm trong máy quang phổ kế. Một ựơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260nm (A260) tương ựương với nồng ựộ 50ộg/ml của DNẠ Nếu giá trị hấp thụ bước sóng 280nm (A280) cũng ựược xác ựịnh, thì tỷ số A260/A280 là chỉ số cho thấy ựộ lẫn các chất như phenol hoặc protein. Tỷ lệ A260/A280 là 1,8 Ờ 2 là DNA ựạt ựộ tinh khiết theo tiêu chuẩn Quốc tế (Lê đình Lương, 2004)[18].
Khuếch ựại ựoạn gen IGF1 bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Thành phần phản ứng PCR:
Phân tử DNA có chứa ựoạn DNA cần nhân bản và chỉ cần biết trình tự nucleotide của ựoạn nhỏ nằm cạnh ựoạn cần nhân ựể thiết kế hai mồi oligonucleotidẹ
Hai ựoạn mồi ngắn ựể xác ựịnh các ựiểm bắt ựầu tổng hợp DNẠ đây là tắn hiệu chỉ hướng ựi (5Ỗ - 3Ỗ) của enzyme DNA - polymerasẹ Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai ựầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung.
Cặp mồi ựược sử dụng ựể nhân ựoạn gen mã hóa IGF-1, ký hiệu là IGF-1_F và IGF-1_R ựược thiết kế dựa trên trình tự gen IGF-1 ựã công bố trong Genbank ựược ựặt tổng hợp tại hãng IDT với trình tự như sau:
IGF-1_F: GCC TCC CCC ACA CTT TAT CA IGF-1_R: GAA TTT GTG CAG CTC TCA GGA
Sử dụng cặp mồi này sẽ nhân ựược ựoạn gen có kắch thước khoảng 1,1kb
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 32 Dung dịch ựệm cung cấp ion Mg2+ và nước tinh khiết không có enzyme RNase và DNasẹ
Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase [4], [40].
Dung tắch tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 - 50 ộl.
Thành phần phản ứng khuếch ựại ựoạn DNA chúng tôi ựã sử dụng cho gà HỖMông và gà Ri với tổng thể tắch 25 ộl như trong bảng
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng khuếch ựại DNA
Thành phần Nồng ựộ Thể tắch (ộộộộl) Buffer 10 X 2,5 MgCl2 10 mM 2,5 dNTPs 10 mM 2,5 IGF-1_F 10 pmol/ ộl 0.5 IGF-1_R 10 pmol/ ộl 0.5
Taq DNA polymerase 5 unit/ ộl 0,13
DNA khuôn 15 ng 3
H2O - 13.35
Tổng thể tắch 25
Chu trình nhiệt của PCR:
PCR là loại phản ứng ựòi hỏi sự chắnh xác về chu trình nhiệt của phản ứng cũng như thành phần và nồng ựộ các chất tham giạ Tổng số chu kỳ chúng tôi tiến hành là 35, mỗi chu kỳ gồm 3 giai ựoạn chắnh như sau:
- Giai ựoạn biến tắnh DNA bằng nhiệt: tách sợi DNA kép thành dạng sợi ựơn (single strands). Tất cả các phản ứng enzyme (phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước ựó) trong giai ựoạn này ựều bị dừng lạị Mỗi sợi ựơn sau ựó sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vàọ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 33 Nhiệt ựộ: 94 - 95oC, tại nhiệt ựộ này các phân tử DNA mạch kép bị tách ra do sự ựứt gãy của các liên kết hydro; và ựể ựảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq DNA polymerase vẫn giữ ựược hoạt tắnh. Thời gian biến tắnh tuỳ thuộc vào hàm lượng G - C và chiều dài phân tử DNẠ Chúng tôi chọn nhiệt ựộ biến tắnh là 940, thời gian 1 phút.
- Giai ựoạn gắn mồi: thực hiện phản ứng lai giữa mồi và DNA khuôn. Các mồi ựược gắn vào vị trắ có trình tự tương ựồng ở DNA khuôn mẫu, mồi bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển ựộng Brown vì thế các liên kết ion ựược tạo thành và ựứt gãy liên tục giữa mồi sợi ựơn và DNA khuôn sợi ựơn. Các liên kết ion ổn ựịnh hơn tạo thành một ựoạn nhỏ (các mồi ựã lắp ráp chắnh xác) và trên các ựoạn nhỏ DNA sợi ựôi ựó (DNA khuôn và mồi) Taq polymerase có thể bắt ựầu quá trình sao chép khuôn mẫụ Nhiệt ựộ trong thắ nghiệm này là 54oC. Thời gian của giai ựoạn gắn mồi là 1 phút.
Giai ựoạn kéo dài: nhiệt ựộ lúc này ựược nâng lên ựến 72oC, ựây là nhiệt ựộ tối thắch cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bằng cách bổ sung các dNTP bắt ựầu từ các vị trắ có mồi gắn vào theo chiều 5Ỗ - 3Ỗ. Ở nhiệt ựộ này, các mồi bắt cặp chắnh xác không bị rời khỏi DNA khuôn mẫu do có các mối liên kết ion mạnh hơn lực phá vỡ liên kết, trong khi ựó các mồi ở các vị trắ bắt cặp không chắnh xác sẽ bị rời ra khỏi khuôn (do nhiệt ựộ cao) do ựó không tổng hợp ựược DNA từ những mồi nàỵ Thời gian của giai ựoạn này từ