XV. Phương pháp "vân tay DNA" (DNA finger print)
2. Phương pháp mẫu dò lạnh (cold probe)
Trước đây các phương pháp lai đều sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ. Về sau thay vì chế tác và sử dụng những mẫu dò phóng xạ người ta kết hợp kháng thể với enzyme và lợi dụng hoạt tính của enzyme để phát màu cơ chất giúp phát hiện băng đặc hiệu, được gọi là phương pháp mẫu dò lạnh. Nhìn chung phương pháp sử dụng mẫu dò lạnh có độ phiền phức và mất thời gian tương tự phương pháp sử dụng mẫu dò phóng xạ. Trong trường hợp này tính bổ sung giữa mẫu dò với DNA tế bào trở nên giảm nên các bước rửa cần phải nhẹ nhàng. Nếu sử dụng các mẫu dò phóng xạ thì việc kiểm tra chất lượng nền trong quá trình rửa thực hiện được nhờ máy đo phóng xạ rất dễ dàng, và nếu rửa chưa đủ nên nền còn độ phóng xạ cao thì tiếp tục rửa cho đến khi nền giảm xạ. Phương pháp mẫu dò lạnh không có ưu điểm này, phải thực hiện chọn đến khi phát màu. Ví dụ dưới đây mô tả phương pháp mẫu dò lạnh với probe của hãng Amersham Life Science gọi là phương pháp ECL.
Trong trường hợp này probe được kết hợp trực tiếp với enzyme và kiểm xuất trên film sự phát huỳnh quang của tổ hợp do phản ứng hóa học phát ra. Thời gian lộ quang khoảng 1 giờ (trong lúc này một tấm Hyperfilm được đặt ép lên màng Saran wrap phủ trên màng đang phản ứng, sau đó rửa film và đọc kết quả. Phương pháp này đơn giản, thực hiện và đọc thuyết minh một cách dễ dàng. Người ta cũng đã sử dụng vào việc giám biệt quan hệ huyết thống (tìm bố thực hay bố sinh học cho con...). Từ các làn DNA của hai người bố cũng như của người mẹ có khoảng 10 băng nhìn thấy rõ và 5 - 6 băng mờ hơn. Trong các băng đó có khá nhiều băng có sự khác biệt về độ lớn, nhờ vậy hình thành dấu "vân tay" DNA rất riêng biệt của cá thể. Có thể nhìn thấy đồng thời tính đa hình các đoạn hạn chế của nhiều đoạn DNA.
Tuy nhiên, nếu quan sát kỹ các băng trong dấu "vân tay" DNA thì nhất định thấy một số băng của làn DNA của người con có độ dài tương tự 1 6 2
Hình 17: Kết quả xét nghiệm DNA finger print xác nhận huyết thống (tìm bố sinh học cho con)
Làn 1: DNA bố hộ tịch, làn 2: DNA bố sinh học, làn 3: DNA của con và 4: DNA của mẹ. Con và mẹ cũng như con và bố sinh học có các băng giống nhau.
1 2 3 4
cặp băng chung bố và con cặp băng chung bố và con
cặp băng chung mẹ và con kb
với một số băng nhìn thấy được trong làn DNA của bố thực sự (bố sinh học) và một số khác thấy trong làn DNA của mẹ thực sự. Còn trong làn DNA của bố hộ tịch hoàn toàn không có những băng có độ dài tương tự các băng của làn DNA của con (cũng như của mẹ).
Phương pháp này áp dụng trong việc đồng định cá thể (xác định tội phạm...), giám biệt cha mẹ - con cái cũng như kiểm tra xác nhận sự kết bám, khu trú của tế bào của người cho trong cơ thể của người nhận.
*Các bước kỹ thuật:
1) Các mẫu DNA (của con, bố hộ tịch và bố sinh học cũng như của mẹ) phải được xử lý như nhau. Chiết xuất và tinh chế DNA, đo hàm lượng (khoảng 3 µg DNA trong 5 µl cho mỗi loại phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế là vừa).
2) Ủ DNA tế bào với loại enzyme hạn chế đã chọn. Nên dùng các enzyme nhận biết và cắt 4 base. Nếu cần, sử dụng đồng thời hai enzyme cho một ống phản ứng.
3) Xử lý bằng phenol: cho thêm phenol vào ống rồi trộn đều để khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng hoặc trên băng (nước đá), quay li tâm 3 phút ở 2.000 - 3.000 v/ph để lớp phenol (cùng với tủa protein) tách khỏi lớp nước chứa DNA hòa tan. Hút lấy lớp nước này, trộn dịch màu.
4) Chuẩn bị gel agarose trong TBE như trình bày trước đây. Nồng độ agarose khá cao (1,2 - 2%) để tăng độ phân giải.
5) Điện di với dung dịch đệm TBE, không cần nhuộm ethidium bromide. 6) Làm biến tính (phương pháp kiềm, sau đó trung hòa).
7) Chuyển qua màng (nylon, nitrocellulose). Có thể tăng sự cố định DNA trên màng bằng cách để khoảng 4 - 5 cm dưới một đèn tử ngoại và chiếu tử ngoại 3 phút. Làm khô (với phương pháp làm khô nhanh thì tốt).
8) Lai tiền khởi (khoảng 1 - 3 giờ ở khoảng 35 ºC, nhiệt độ cao hay thấp được tính tùy theo độ dài mẫu dò và tỷ lệ G+C trong đó).
9) Lai với mẫu dò minisatellite đánh dấu enzyme (khoảng 10 giờ hay qua đêm ở khoảng 35 ºC).
10) Rửa màng bằng TBE, thay dịch rửa một số lần.
11) Không làm khô màng, cho màng vào túi polyethylene rồi thêm vào đó dịch cơ chất màu (ECL, cũng có thể CDP-Star, hãng Amersham) tương ứng với enzyme. Hàn kín các cạnh của túi bằng máy ép gia nhiệt.
12) Đưa vào buồng tối để hiện hình, ép một tấm Hyperfilm lên màng. Để tự ký qua đêm ở −20 hay −70 ºC. Rửa hiện ảnh trên film. Hong khô film. Đọc và phân tích kết quả.
Chú ý: Thuộc nhóm mẫu dò quang hóa học (Chemilluminescent probe) này còn có LumiGLO của hãng Cruachem Inc., CSPD của hãng ICN Pharmaceuticals...