Đây là phương pháp xác định lượng gen được phiên mã trong thời khắc nhất định. Những thực nghiệm về phiên mã sử dụng nhân tế bào đã được phân li thường là kết quả của sự tiếp tục phiên mã của các gen đã bắt đầu quá trình phiên thành RNA thông tin từ trước và khi thử nghiệm quá trình đó được tiếp tục cho đến hoàn thành mà có thể không có gen mới được phiên mã. Như vậy, nếu sử dụng một yếu tố cảm ứng nào đó để kích thích phiên mã thì kết quả nghiên cứu sẽ bị che lấp hoặc hiểu sai. Nếu sử dụng [32P] đánh dấu sản phẩm phiên mã của nhân đã phân li và kiểm tra RNA đã được đánh dấu bằng gen xác định thì có thể biết được gen được phiên mã đến mức nào vào thời điểm phân li.
1. Phân li nhân
1) Thực hiện các bước trong thí nghiệm này ở 0 - 4 ºC (để các ống thí nghiệm trong nước đá). Rửa tế bào nuôi cấy trong đĩa các petri bằng dung dịch đệm PBS(-) hai lần, sau đó cạo tế bào vào trong dung dịch SSC 1× (ở ống nghiệm 15 ml), quay li tâm 1.500 v/ph trong 5 phút rồi đổ hết hoàn toàn nước mặt thu tế bào.
2) Thêm 0,5 ml dung dịch đệm TNM-NP40, trộn đều để tạo huyền dịch bằng cách đưa đầu ống pipet loại 1 ml xuống tận đáy ống và hút nhả khoảng 10 - 15 lần. Chú ý để ở nhiệt độ dưới 4 ºC.
Dung dịch đệm TNM-NP40 chứa Tris-HCl (pH 7,4)
10mM, NaCl 10mM, MgCl2 3mM và nonident P-40 0,5%.
3) Để yên trên nước đá 10 phút sau đó chuyển sang ống Eppendorf, quay li tâm 3.000 v/ph trong 5 phút. Thu nước mặt bảo quản riêng vì đây là phân đoạn RNA tế bào chất. Còn cặn là phân đoạn nhân tế bào. Rửa cặn hai lần trong 1 ml dung dịch đệm TNM-NP40 nêu trên (kết hợp quay li tâm). 4) Huyền dịch hóa phân đoạn nhân vào 100 µl dung dịch đệm huyền dịch hóa bằng cách dùng pipet hút nhả một số lần.
Dung dịch đệm huyền dịch hóa chứa Tris-HCl (pH 8,3)
50mM, glycerol 40%, MgCl2 5mM và EDTA 0,1mM.
2. Thẩm đốm lên màng
1) Hòa tan khoảng 5 - 10 µg DNA plasmid (tái tổ hợp mang gen và đã clone hóa trong E. coli) đã bị cắt bởi ít nhất hai vị trí trong 50 µl NaOH
0,2N trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
2) Thêm 500 µl (lượng gấp 10 lần) dung dịch SSC 6×, trộn đều. Thẩm đốm dung dịch DNA này lên màng nitrocellulose hoặc nylon đã cân bằng cũng bằng dung dịch SSC 6× đã lắp trong thiết bị thẩm đốm (blotting apparatus). Liều lượng khoảng 1 ml/đốm. Cho hút để thẩm đốm nhanh. Để khô trong không khí rồi sấy khô ở 80 ºC trong khoảng 2 giờ.
3. Điều chế ARN tổ chức
1) Thêm 100 µl dịch phản ứng vào dịch nhân (đã được điều chế theo 1.) và cho phản ứng tổng hợp RNA xảy ra trong 30 phút ở 30 ºC. (RNA- polymerase có trong dịch nhân tiếp tục xúc tác phản ứng tổng hợp RNA).
Dịch phản ứng chứa Tris-HCl (pH 8,0) 10mM, MgCl2 5mM, KCl 300mM, các ATP, CTP và GTP 0,5mM mỗi loại và [α- 32P]UTP 100μCi (3.000 Ci/mM).
2) Thêm DNase I cho đạt 20 µg/ml rồi để 10 phút ở 30 ºC cho phản ứng (phân giải DNA) xảy ra.
3) Thêm 200 µl (lượng tương đương) dung dịch dừng phản ứng, ủ 30 phút ở 42 ºC.
Dung dịch dừngphản ứng chứa Tris-HCl (pH 7,4) 20mM,
SDS 2%, EDTA 10mM và proteinase K 200µg/ml.
4) Xử lý phenol-chloroform (1:1), hút nước mặt sang ống mới (ống Falcon 2059...).
5) Thêm 50 µg carrier RNA, rồi thêm 5 µl dung dịch TCA 5% đã được làm lạnh ở trong nước đá.
Dung dịch TCA 5% là dung dịch Na4P2O4 30mM.
6) Để yên trong nước đá 30 phút sau đó lọc qua màng lọc nitrocellulose (hoặc nylon) đường kính 2,5 cm và tráng màng bằng 10 ml dung dịch TCA 5% ba lần.
7) Chuyển màng lọc sang chai scintillation, thêm 0,9 ml dung dịch ủ. Để 37 ºC trong 30 phút cho phản ứng xảy ra. (Thực hiện trong chai scintillation để dễ kiểm tra nồng độ phóng xạ, nếu cần).
Dung dịch ủ chứa HEPES (pH 7,5) 20mM, MgCl2 5mM,
CaCl2 1mM và DNase I 25µg/ml.
8) Thêm 30 µl EDTA 0,5M và 100 µl SDS 10% (nồng độ cuối cùng tương 1 2 4
ứng là 15mM và 1%). Để cho phản ứng ở 60 ºC trong 10 phút.
9) Sau phản ứng,chuyển dịch phản ứng (khoảng 1 ml) sang ống loại 10 ml. Thêm vào chai scintilation 0,5 ml dung dịch rửa, xử lý 10 phút ở 65 ºC. Sau đó hút dung dịch rửa trộn với dịch phản ứng đã hút ra trước khi xử lý dung dịch rửa. Dịch hỗn hợp thu được khoảng 1,5 ml.
Dung dịch rửa chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, SDS 1% và
EDTA 5mM.
10) Thêm 40 µg proteinase K (nồng độ cuối cùng 25 µg/ml), cho phản ứng xảy ra ở 37 ºC trong 30 phút.
11) Thêm dung dịch NaCl vào dịch phản ứng cho đạt nồng độ 0,1M và 2,5 lần thể tích ethanol, để 10 phút ở −80 ºC cho kết tủa. Quay li tâm 10.000 v/ph trong 10 phút thu tủa sản phẩm. Hòa tủa này trong 50 µl TE.
TE chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM và EDTA 2mM.
4. Hybridization
1) Ngâm màng đã thẩm đốm DNA plasmid (bước 2.) vào dung dịch run- on assay prehybridization (1 ml cho một màng có diện tích khoảng 20 cm2) trong 4 - 16 giờ ở 42 ºC.
Dung dịch run-on assay prehybridization (dịch lai tiền
khởi cho run-on assay) chứa formamide ở nồng độ 50%, sodium phosphate (pH 6,5) 50mM, SSC 5× (25 ml SSC 20× trong 100 ml), DNA tinh dịch cá hồi biến tính 250 µg/ml và Denhardt 1× (10 ml dung dịch Denhardt 10× trong 100 ml).
2) Thay bằng dung dịch run-on assay hybridization (dịch lai). Tiến hành lai trong 48 giờ ở 42 ºC.
Dung dịch run-on assay hybridization (dịch lai cho run-
on assay) chứa 4 phần dịch run-on assay prehybridization và 1 phần dung dịch dextran sulfate 50%.
3) Rửa màng bằng 100 ml dung dịch chứa SSC 2× và SDS 0,1% ba lần ở nhiệt độ phòng mỗi lần 5 phút.
4) Rửa màng bằng 100 ml dung dịch chứa SSC 2× và SDS 0,1% hai lần ở nhiệt độ 65 ºC mỗi lần 15 phút.
5) Hong khô, gói trong giấy nhựa mỏng (Saran wrap), thực hiện tự ký phóng xạ.
mã của một hệ phiên mã in vitro (sau khi phá tế bào) nếu tiếp tục diễn ra sẽ tổng hợp RNA có chứa [α-32P]UTP, vì vậy đốm (blot) tương ứng sẽ cho kết quả phóng xạ dương tính. Run-on assay như vậy chỉ cho ta thấy hệ nào được cảm ứng phiên mã (bởi hóa chất cảm ứng nào đó, chẳng hạn) tại thời điểm đình chỉ nuôi cấy tế bào.