V. Hệ phiên mã in vitro
1.1. Dịch chiết xuất toàn tế bào
1) Nuôi cấy tế bào HeLa đạt đến kỳ phát triển theo cấp số nhân (0,3×105) rồi quay li tâm 3.000 v/ph trong 5 - 6 phút để tập trung tế bào. Lại huyền dịch hóa tế bào (cặn) trong PBS rồi quay li tâm loại bỏ nước mặt. Lặp lại việc rửa tế bào như vậy 2 - 3 lần. Ở trạng thái này nếu muốn bảo quản tế bào thì đưa vào điều kiện −80 ºC có thể bảo quản lâu gần như vĩnh cửu. 2) Huyền dịch hóa tế bào trong 4 lần dung dịch đệm I. Để ở nhiệt độ phòng 20 phút.
Dung dịch đệm I chứa Tris-HCl (pH 7,9) 10mM, EDTA
1mM và DTT 5mM (DTT thêm vào trước khi dùng). 3) Nghiền đều bằng Dounce homogenizer (chày B) 10 - 15 lần.
4) Thêm dung dịch đệm II bằng 4 lần lượng cặn trước khi nghiền, lắc đều nhẹ nhàng.
Dung dịch đệm II chứa Tris-HCl (pH 7,9) 50mM, MgCl2
10mM, saccharose 25%, glycerol 50% và DTT 2mM.
5) Đặt dịch lên máy khuấy từ rồi cho khuấy nhẹ nhàng, trong khi đó dùng pipet cho từng giọt ammonium sulfate bão hòa cho đến khi lượng ammonium sulfate đạt đến 1/2 - 2/3 dung dịch thì độ nhớt tăng máy chạy khó, khi đó cần tăng tốc độ khuấy.
Chú ý cho ammonium sulfate vào từ từ từng lượng rất nhỏ vì nếu ngay từ đầu mà cho nhiều thì tăng độ nhớt nhanh chóng nhưng dịch không được trộn đều.
6) Khuấy từ từ cho dịch được trộn đều trong 20 - 30 phút.
ống li tâm và rotor li tâm thích hợp (chẳng hạn, rotor Hitachi RP 42, rotor Hitachi RP 65 T, với ống 94 PA).
8) Chuyển lớp nước mặt sang ống khác, chú ý không làm trộn lớp dưới. Khi đó cần chú ý đừng hút theo lớp DNA nằm sát lớp tủa ở đáy ống.
9) Khuấy trên máy khuấy từ tính, khi đó thêm từ từ một lượng ammonium sulfate bột cho đạt đến 0,33 g/ml so với lượng nước mặt. Sau khi ammonium sulfate tan hết thì thêm NaOH 1 N ở mức 10 ml cho mỗi gam ammonium sulfate, lại trộn đều trong 30 phút.
10) Quay li tâm 16.000 v/ph trong 20 phút. Có thể dùng rotor RPR Hitachi hoặc rotor Sorvall...
11) Loại bỏ nước mặt (dốc ống đổ ra cũng được), hòa tan tủa trong dung dịch đệm III với lượng bằng 1/10 lượng dịch mặt thu được từ bước 8) nêu trên.
Dung dịch đệm III chứa HEPES-KOH (pH 7,9) 20mM,
EDTA 0,2mM, KCl 0,1mM, glycerol 17%, DTT 1mM và MgCl2 12,5mM.
12) Thẩm tích đối dung dịch đệm III trong 10 - 12 giờ, ngoại dịch có thể khoảng 100 lần lớn hơn dịch trong túi thẩm tích, thay dịch giữa chừng thì tốt vì nồng độ muối trong sản phẩm là khá cao.
13) Quay li tâm 10.000 v/ph trong 10 phút để loại bỏ những vật không hòa tan.
14) Chia ra nhiều ống nhỏ cho tiện bảo quản và sử dụng, đưa vào nitơ lỏng để đông kết nhanh rồi bảo quản ở −80 ºC. Thời gian bảo quản được biết là một năm hoặc lâu hơn.