XIII. Phương pháp tạo thể đột biến nhân tạo
1. Chế tác thể đột biến khuyết tổn
Có thể dùng exonuclease Bal 31 trong chế tác một loạt thể biến dị khuyết tổn có phương hướng từ đầu phân tử DNA. Enzyme này tiêu hóa dần DNA với vận tốc khoảng 50 bp/phút. Vì vậy tùy thời gian ủ mà ta có sản phẩm thu được dài hay ngắn.
Vấn đề quan trọng là ở chỗ làm thế nào để có thể tiêu hóa đoạn DNA xác định từ một hướng. Để thực hiện được việc này người ta clone hóa DNA xác định vào plasmid bằng hai enzyme hạn chế khác nhau, chẳng hạn A và B, (ta có plasmid mạch vòng), sau đó dùng một trong hai enzyme hạn chế này (chẳng hạn enzyme A) cắt plasmid tại điểm nối (làm plasmid tổ hợp có mạch thẳng). Từ điểm nối này nếu cho DNA phản ứng với Bal 31 thì một đầu của DNA đã định đó và một đầu tự do của plasmid
Hình 13:Một trường hợp xử lý DNA bằng enzyme Bal 31.
DNA bị cắt ngắn dần phụ thuộc thời gian xử lý, lần lượt các làn từ trái sang phải: sau xử lý 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 và 20 phút.
2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0
bị cắt cụt dần. Sau khi cắt bằng Bal 31, người ta dùng enzyme Klenow làm bằng đầu DNA rồi dùng linker kết nối các đầu để có chỗ cho enzyme hạn chế hoạt động, khi đó xử lý lại bằng enzyme hạn chế A sẽ tạo được đầu dính. Đến đây dùng enzyme B cắt tiếp để đoạn còn lại của DNA đích đứt khỏi đoạn DNA còn lại của plasmid. Sau khi phân li (bằng điện di trong gel) và tinh chế, người ta thu lại được đoạn DNA đích đã bị cắt cụt một phần và có hai đầu dính, trong đó một đầu đặc hiệu enzyme A còn đầu khác đặc hiệu enzyme B. Dùng enzyme ligase (T4) kết nối với plasmid có cặp đầu dính tương tự ta sẽ lại tổ hợp được đoạn DNA đích đã bị cắt cụt từ phía enzyme A (nhưng phía enzyme B vẫn nguyên vẹn). Di nạp tổ hợp này vào tế bào khả biến ta có thể kiểm tra được vai trò của phần đã bị cắt cụt của DNA đích. Đương nhiên, việc kiểm soát độ dài bị cắt cụt đi của DNA đích là khó khăn, cho nên người ta phải thực hiện với nhiều clone khuyết tổn khác nhau từ những sản phẩm ủ trong thời gian dài ngắn khác nhau với
Bal 31, sau khi phân tích sự biểu hiện của gen trong các clone người ta tiến hành kiểm tra lại trình tự nucleotide của đoạn còn lại của các clone. Nhờ vậy, vai trò của đoạn cắt cụt cũng như độ dài của trình tự đoạn bị cắt cụt được xác định.
1.1. Tiêu hóa từng phần bằng Bal 31
1) Từ clone đã tìm hiểu vai trò DNA tái tổ hợp ta tinh chế DNA plasmid và lấy khoảng 30 µg cho xử lý Bal 31, sau đó chiết xuất bằng phenol và kết tủa bằng ethanol, tráng tủa DNA bằng ethanol 70% và hòa tan trong 30 µl TE.
2) Thêm vào DNA 150 µl dung dịch đệm Bal 31 2× và 70 µl nước cất (tổng lượng 250 µl), ủ tiền khởi 10 phút ở 30 ºC.
Dung dịch đệm Bal 31 2× chứa Tris-HCl (pH 8,0) ở nồng
độ 40mM, MgCl2 24mM, CaCl2 24mM, NaCl 1,2mM và EDTA 2mM.
3) Thêm 50 µl (1 đơn vị/ml) Bal 31 F (thể F) cho phản ứng xảy ra ở 30 ºC. Sau khoảng 2 phút (hay ngắn hơn) lấy từng 30 µl một cho vào ống đã chứa sẵn 2 µl EDTA 0,5M để dừng phản ứng. Kết cục ta có 10 ống dịch đã dừng phản ứng tất cả.
4) Từ các ống lấy mỗi ống khoảng 0,2 µl để thực hiện điện di trong gel agarose để xác nhận kết quả tiêu hóa. Trong gel chứa ethidium bromide, dưới đèn UV ta có thể quan sát các làn với các băng DNA có phân tử lượng nhỏ dần (phụ thuộc vào thời gian xử lý Bal 31).
5) Chọn DNA trong những ống có kết quả tiêu hóa thích hợp (ước chừng 1 4 4
nên cần chọn nhiều ống). Thực hiện chiết xuất bằng phenol-chloroform rồi kết tủa bằng ethanol. Có thể chiết xuất và tinh chế trước rồi thực hiện điện di kiểm tra từ bước này (thay cho bước 4) ở trên) cũng được.
1.2. Tạo dòng phụ (subcloning) đoạn khuyết tổn
1) Hòa tan DNA khuyết tổn trong 10 µl TE, xử lý bằng enzyme Klenow và dNTP để tạo đầu bằng của DNA (như đã mô tả trên đây). Vô hoạt enzyme bằng cách đun nóng 70 ºC trong 5 phút, rồi để nguyên như vậy thực hiện phản ứng gắn linker.
2) Thực hiện phản ứng kết nối linker (như mô tả trước đây). Tiêu hóa bằng enzyme hạn chế A và B (cùng lúc cũng được).
3) Điện di sản phẩm trong gel agarose để thu hồi các đoạn DNA khuyết
Hình 13: Sơ đồ quy trình thực hiện tạo thể đột biến đoạn sử dụng Bal 31.
DNA nguyên bản được clone hóa trong plasmid nhờ hai ezyme hạn chế (A và B) bị cắt ở một trong hai vị trí đó (A); 2) cắt dần DNA bởi Sal 31; 3) Làm bằng đầu các DNA bằng Klenow; 4) nối linker tạo vị trí nhận biết của enzyme A; 5) và 6) Cắt bằng cả hai enzyme A và enzyme B; 7) Điện di phân tách; 8) Di nạp DNA đích vào plasmid mới.
A B
A B
tổn (đã gắn linker) có độ dài thích hợp.
4) Tổ hợp DNA đích vào khoảng A và B của plasmid vector.
Chú ý: Ngoài Bal 31 còn có thể sử dụng exonuclease khác, như exonuclease III chỉ cắt DNA từ đầu dính 5' mà không cắt đầu dính 3' nên có thể thực hiện biến dị khuyết tổn từ một phía. Kit biến dị khuyết tổn có thể đặt mua từ công ty Takara...