M, dấu thang phân tử lượng; S, sản phẩm PCR được điện di trong gel agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và kích thích bằng UV.
2. Một số kỹ thuật mở rộng áp dụng PCR
Kỹ thuật PCR ngày càng được sử dụng rộng rãi do nguyên lý đơn giản, thao tác tự động hóa, cho kết quả có tính đặc hiệu và độ nhạy cao.
Về mặt kỹ thuật, PCR còn được phát triển thành dạng mới là real- time PCR, bên cạnh nhiều ứng dụng mở rộng của PCR truyền thống được sáng tạo và phát huy tác dụng.
PCR thực thời (real-time PCR) được phát triển trên cơ sơ phản
ứng PCR thông thường với cặp mồi đặc hiệu và một mẫu dò chỉ hấp thụ và phát xạ (bức xạ bước sóng đặc hiệu) khi gắn với ADN đoạn giữa hai mồi tổ hợp với thiết bị trắc định cường độ phát xạ của mẫu dò. Thiết bị nhân DNA được chế tạo đặc biệt để các phản ứng vừa có thể diễn ra nhưng đồng thời chất phát quang gắn trên mồi cũng phát quang sau khi gắn vào DNA được tổng hợp dưới tác động của bức xạ kích thích. Mồi cũng được thiết kế đặc biệt, gắn kết với hợp chất phát xạ huỳnh quang khi có bức xạ kích thích thích hợp nhưng do hợp chất khác (quencher) cũng được gắn trên mồi làm tắt bức xạ nên chỉ khi mồi tham gia phản ứng tổng hợp DNA mà tách khỏi ảnh hưởng của quencher thì bức xạ huỳnh quang đánh dấu mới xuất hiện. Bức xạ do mồi gắn trong chuỗi DNA phát ra được máy thu ghi lại truyền sang vi tính nên có thể phát hiện được sản phẩm DNA được hình thành trong suốt quá trình phản ứng. Nhờ vậy, PCR thực thời còn được vận dụng để định lượng DNA khuôn đưa vào phản ứng dựa vào nguyên tắc lượng DNA khuôn càng cao thì thời gian phản ứng càng ngắn để cùng có lượng DNA tối đa từ thành phần tham gia phản ứng không đổi. Kỹ thuật cụ thể liên quan real-time PCR không trình bày trong chương trình này. Các hướng dẫn thao tác (protocol) liên quan đến chuẩn bị hỗn
hợp phản ứng và thiết định chế độ luân nhiệt và đọc kết quả lưu trữ lại (protocol file và master file) được cung cấp kèm theo real-time PCR thermocycler và mồi cần được đọc kỹ trước khi thực hiện.
In situ PCR, hay PCR tại chỗ, là thiết bị luân nhiệt được thiết kế
để tổng hợp DNA trực tiếp từ tổ chức bệnh phẩm (lát cắt tổ chức...) đã được cố định trên phiến kính. Vì vậy, nếu có mặt trong tiêu bản DNA đặc hiệu sẽ được khuyếch đại và sản phẩm, sau khi được nhuộm bằng phương pháp thích hợp, có thể được quan sát dưới kính hiển vi. Vì vậy vị trí phân bố của mầm bệnh trong tổ chức bệnh phẩm có thể được xác định.
Hot start PCR là kỹ thuật PCR thông thường được khởi động
nóng là biện pháp làm tăng tính đặc hiệu của sự bắt cặp mồi.
Inverse PCR là một biến tướng của PCR thông thường với những
thủ thuật cắt nối hoặc mồi ngẫu nhiên, hoặc mồi chế theo trình tự nucleotide của gen nhảy để sao chép đoạn DNA nằm ngoài đoạn DNA có trình tự đã biết.
Có thể nói đây không chỉ là một kỹ thuật mà là một chiến lược tổng quát bao gồm việc vận dụng nhiều kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử nhằm phân lập ra được đoạn DNA nằm kề đoạn DNA có trình tự đã biết dưới dạng đoạn được dòng hóa trong E. coli nhờ plasmid hoặc phage.
Hình 16 dưới đây trình bày khái quát các bước của một số kỹ thuật inverse PCR: 1) "tạo vòng" (circulation) và 2) "sắp xếp lại" (reordering).
1 5 6 Nguồn bức xạ kính lọc bức xạ kích thích kính lọc bức xạ cảm ứng đầu đọc
Máy luân nhiệt
các bức xạ tản mát
Hai chiến lược trên có điểm chung là dùng enzyme hạn chế (RE, phù hợp với plasmid được sử dụng khi biến nạp) cắt ngắn DNA nguyên liệu nhưng khác nhau ở chỗ với kỹ thuật tạo vòng thì đoạn DNA đã biết nhất thiết không bị cắt đứt còn trong kỹ thuật sắp xếp lại đoạn DNA này cần bị cắt đứt một (hoặc một vài chỗ) sao cho sản phẩm cắt đủ dài để có thể thu hồi lại từ agarose gel sau khi điện di sản phẩm cắt.
Hình 16: Sơ đồ hai chiến lược sử dụng inverse PCR để giải trình đoạn DNA chưa biết kề bên đoạn đã biết (Theo Pham HS và CS, 1999).