XIII. Phương pháp tạo thể đột biến nhân tạo
2. Chế tác thể đột biến vị trí chỉ định
2.2. Phương pháp sử dụng DNA tổng hợp như đoạn ghép (phương pháp biến dị cassette)
pháp biến dị cassette)
Chế tác DNA tổng hợp, hợp nối để chế plasmid mang biến dị có mục đích. Có thể điều chế nhiều biến chủng đa dạng một cách rất đơn giản.
1) Tìm biết các vị trí cắt của enzyme hạn chế phía trên và phía dưới đoạn DNA đích muốn kiểm tra. Khoảng cách giữa hai vị trí này khoảng 20 - 100 base thì tốt. Nếu không có những vị trí như vậy thì sử dụng phương pháp sử dụng DNA tổng hợp như mồi di nhập biến dị (mục 2.1.) để tạo vị trí enzyme hạn chế thích hợp. Đây là điểm thiết yếu nhất.
2) Bằng enzyme hạn chế loại bỏ đoạn DNA muốn di nhập biến dị, phần còn lại của DNA với plasmid được phân li và sử dụng ở các bước sau như một vector.
3) Cả hai sợi dương và âm đều được tổng hợp nhưng sự tổng hợp của chúng khác nhau. Làm các đầu trên và dưới bổ sung với phía vector. Khoảng 20 - 30 base thêm thì tốt.
4) Sau khi phosphoryl hóa đầu 5' trộn từng 0,5 pmol (20-mer thì khoảng 100 pmol tương đương 1 µg), kết tủa bằng ethanol.
5) Hòa tan trong 9 µl nước cất, thêm 1,2 µl dung dịch đệm A, ủ 1 giờ ở 37 ºC.
Dung dịch đệm A chứa Tris-HCl (pH 7,5) ở nồng độ 0,5M,
6) Thêm 0,02 pmol DNA vector (~0,1 µg), 1 µl ATP 10mM và 1 µl ligase, thực hiện kết nối (ligate) 1 đêm ở 15 ºC.
7) Dùng sản phẩm di nạp vào E. coli.
8) Giải đọc trình tự nucleotide của DNA để xác định biến dị.
XIV. PCR
1. PCR
PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp có thể tăng lượng đoạn DNA đặc hiệu từ mẫu DNA vi lượng khoảng 200 - 500 nghìn lần sau 2 - 3 giờ xử lý. Do đó, đây là phương pháp làm thuận lợi những kỹ thuật DNA tái tổ hợp cũng như được vận dụng trong giải trình DNA, chẩn đoán bệnh cảm nhiễm... Phương pháp này thành công trên cơ sở phát kiến enzyme chịu nhiệt và sáng tạo máy luân nhiệt tự động hóa (programmed thermocycler). Lượng phản ứng có thể từ 5 - 100 µl. Tùy loại máy luân nhiệt mà cần (thế hệ cũ) hoặc không cần sử dụng dầu khoáng chống bốc hơi của dịch phản ứng, các máy thế hệ mới có hệ thống cung cấp nhiệt ở nắp máy đậy trên các ống phản ứng nên không cần đến lớp dầu này. Sơ đồ nguyên lý phản ứng như sau:
1) Tổng hợp 2 loại mồi (primer). Kiểm tra trình tự nucleotide hai đầu đoạn DNA cần khuyếch đại (tăng lượng) và trình tự tương đồng với chúng sao cho hướng của quá trình tổng hợp nối dài DNA từ một primer sẽ tổng hợp
Hình 14: Sơ đồ Nguyên lý hoạt động của PCR.