DNA đặc hiệu
Đây là phương pháp cho kết hợp protein với trình tự DNA đặc hiệu để xác định và phân lập các protein liên quan quá trình phiên mã gen, quá trình tự sao (phục chế DNA) cũng như liên quan quá trình ức chế tái tổ hợp... Đây là phương pháp lợi dụng lực kết hợp mạnh giữa protein với đoạn DNA chứa trình tự nucleotide đặc hiệu mà protein đó nhận biết và kết hợp với. Phương pháp này được thử khá sớm nhưng kể từ khi một số nhà nghiên cứu áp dụng để tinh chế yếu tố phiên mã SP1 nhờ kết hợp oligonucleotide tổng hợp thì phương pháp nghiên cứu này trở nên ứng dụng rộng rãi.
1. Điều chế DNA
Nhìn chung, phương pháp sử dụng oligonucletiode tổng hợp được sử dụng rộng rãi hơn phương pháp sử dụng đoạn DNA đặc hiệu đã biến tính. Nhờ phương pháp này có thể tinh chế protein với hiệu suất cao, tỷ suất thu hồi protein đích lớn và giảm được lượng protein tạp nhiễm đến mức tối thiểu nên không cần áp dụng các biện pháp sơ chế hay loại bỏ bớt. Để làm được điều đó, cần sử dụng những cột sắc ký được chế tác trong đó đảm thể (vật mang hay cơ chất mang) được gắn trực tiếp với DNA chứa chỉ trình tự nucleotide thiết yếu nhất có lực kết hợp cao với protein mục tiêu. Cần chế tác những đoạn DNA chứa trình tự nucleotide như thế và tạo đầu lồi (đầu dính) bổ sung chứa 2 - 4 nucleotide và từ đầu dính đó thiết kế nucleotide tổng hợp được kéo dài thêm còn các gốc amino của nucleotide (của gốc purine và pyrimidine) dùng để kết hợp với sepharose được hoạt hóa bằng CNBr. Dưới đây mô tả trường hợp oligonucleotide tổng hợp được sử dụng trong quá trình tinh chế SP1. Khi đó đoạn nucleotide tổng hợp bổ sung trong trường hợp này là:
5'-G ATC GGG GCG GGG C-3'
C TAG 3'- CCC CGC CCC GTA C-5'
1) Hòa tan oligonucleotide tổng hợp mỗi đầu khoảng 200 µg trong 10 µl
dung dịch đệm kinase 10× và 65 µl nước cất. Sau đó xử lý nhiệt ở các mức giảm dần 90 ºC 2 phút, 65 ºC 10 phút, 37 ºC 10 phút, nhiệt độ phòng 5 phút để cho bắt cặp (anneal).
Dung dịch đệm kinase 10× chứa Tris-HCl (pH 7,5) 0,5M,
MgCl2 0,1M, DTT 0,05M, spermidine 0,01M và EDTA 0,01M. 1 3 8
2) Để có đầu 5' được phosphoryl hóa, thêm 10 µl ATP 200mM, 0,5 µl [γ- 32P]ATP (với mục đích kiểm tra tỷ suất DNA gắn kết đảm thể cột sắc ký), 10 µl T4 polynucleotide kinase (100 đơn vị/µl) và 4,5 µl nước cất, ủ ở 37 ºC trong 2 giờ.
3) Ủ ở 65 ºC trong 15 phút để dừng phản ứng, sau đó thêm 10 µl sodium citrate 5M, 25 µl MgCl2 100mM và 25 µl nước, kết tủa bằng ethanol. 4) Tráng tủa bằng ethanol 70%, sau khi để khô thêm vào tủa DNA 10 µl dung dịch đệm kết nối (ligation buffer solution) và 85 µl nước, hòa trộn kỹ rồi thêm vào đó 5 µl T4 DNA ligase, cho phản ứng xảy ra ở 4 - 16 ºC trong 4 giờ.
5) Chiết xuất bằng phenol, sau đó kết tủa bằng ethanol. Sau khi tráng bằng ethanol 75%, để khô rồi hòa tan trong 100 µl nước. Lặp đi lặp lại mấy lần thao tác kết tủa bằng ethanol để loại bỏ hết Tris (vì nhóm amino trong dung dịch có chất Tris ngăn trở sự kết hợp (coupling) DNA với sepharose). 6) Hòa tan trong 100 µl nước.
2. Kết hợp DNA với sepharose đã được hoạt hóa bởi CNBr
Sử dụng sepharose 4 B đã hoạt hóa bởi CNBr (hãng Pharmacia... sản xuất) có thể là phương pháp tốt để chế cột sắc ký gắn kết DNA với đảm thể (vật mang).
1) Cho 1,2 g Sepharose 4 B (sao su hấp phụ) đã hoạt hóa bằng CNBr trong 35 ml dung dịch HCl 1mM trong một ống nghiệm 50 ml (Corning...), trộn đều cho đến khi đồng nhất (làm trong phòng lạnh).
2) Sử dụng một phễu lọc kết nối một bơm chân không hoặc một máy hút để hút dịch cho đến khi Sepharose vừa ráo nước (không được làm khô). Sau đó vừa hút vừa cho thêm 150 ml HCl 1mM để rửa thêm (làm trong phòng lạnh).
3) Cho 15 ml sodium phosphate 10mM (pH 8,2 ở 4 oC) đi qua lọc (làm trong phòng lạnh).
4) Rửa ba lần mỗi lần 15 ml sodium phosphate 10mM (pH 8,2 ở 4 oC) (làm trong phòng lạnh).
5) Huyền dịch hóa Sepharose trong 6 ml dung dịch đệm phosphate, cho vào ống (làm trong phòng lạnh).
6) Thêm vào đó dung dịch DNA đã được chuẩn bị ở trên (mục 1.) (làm trong phòng lạnh).
7) Đảo trộn trong 16 - 18 giờ ở nhiệt độ phòng (dùng máy đảo trộn).
8) Thêm 0,5 ml Tris-HCl 2M (pH 8,0), đảo trộn 2 giờ để phong bế các gốc chưa phản ứng.
9) Dùng phễu lọc thủy tinh lọc 3 lần bằng 10 ml Tris-HCl 0,1M (pH 8,0), 3 lần bằng 10 ml sodium phosphate (pH 8,2) 0,1M, 3 lần bằng 10 ml hỗn hợp NaCl 1,5M và Tris-HCl (pH 8,0) 10mM và cuối cùng 3 lần bằng 10 ml hỗn hợp NaCl 0,1M, Tris-HCl (pH 8,0) 10mM và EDTA 1mM.
Với cách xử lý này có khoảng 60% DNA kết hợp vào cột sắc ký.
3. Tinh chế protein bằng cột Sepharose đã kết hợp DNA có trình tự base đặc hiệu đặc hiệu
Người ta đã sử dụng phương pháp này để tinh chế các protein SP1 , AP1, HSTF, NF1... Cột Sepharose đã kết hợp DNA đặc hiệu có thể sử dụng để tinh chế protein trong dịch chiết xuất toàn tế bào, dịch chiết xuất nhân ở dạng nguyên sơ hoặc các loại dịch đó đã sơ chế qua các cột sắc ký có thể tinh chế nhờ kết hợp mạnh DNA đặc hiệu đó. Tuy nhiên thực tế không đơn giản như vậy. Vì vậy cần loại bỏ bớt nhhững protein khác trong đó có những hợp chất hấp phụ không đặc hiệu với DNA cũng như kiểm tra hàng loạt điều kiện như sử dụng chất tăng hoạt tính bề mặt, tính chất và lượng DNA... Dưới đây là ví dụ về quy trình tinh chế protein SP1 nhờ cột DNA đặc hiệu nêu trên.
Lấy dịch chiết xuất nhân tế bào từ 60 g tế bào HeLa đem lọc qua cột Sephacryl S-300, DEAE Sepharose, Heparin agarose và cột FPLC Mono S để thu mẫu protein sơ chế (khoảng 1,5 mg). Dung dịch protein pha trong dung dịch đệm Tris-HCl (pH 7,9) 50mM, MgCl2 12,5mM, EDTA 1mM, DTT 1mM, glycerol 20% và KCl 0,25M. Trộn với 220 µg DNA tuyến ức của bò đã cắt nhỏ và dung dịch đệm A để hạ nồng độ KCl đến 0,1M. để dung dịch này ở 4 ºC trong 10 phút, sau đó tải lên cột sắc ký hấp phụ. Sau khi rửa bằng dung dịch đệm A, nâng dần nồng độ KCl lên để dung xuất protein. Thu hồi được SP 1 khi nồng độ KCl khoảng 0,4M đến 0,6M.
Dung dịch đệm A chứa HEPES-KOH (pH 7,6) 25mM, MgCl2 12,5mM, DTT 1mM, glycerol 20% và Nonident P-40 0,1%.