Xõy dựng cõy phỏt sinh loài [48,55]
5.1.1. Phõn lập và định loại virus VNNB từ cỏc loại mẫu bệnh phẩm khỏc nhau ở Việt Nam, 2004 – 2007.
nhau ở Việt Nam, 2004 – 2007.
Trong chẩn đoỏn bệnh, phõn lập virus cú ý nghĩa rất quan trọng để xỏc
định tỏc nhõn gõy bệnh. Với một số tỏc nhõn gõy bệnh, phõn lập virus hoặc phỏt hiện khỏng nguyờn virus là tiờu chuẩn bắt buộc để xỏc định ca bệnh như
bệnh bại liệt, tiờu chẩy do virus Rota...[1,6,9,38]. Nhưng đối với một số bệnh do virus Arbo truyền, phõn lập virus thường ớt đạt kết quả do cú nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phõn lập virus như: (1) Thời gian lấy mẫu; (2) Hiệu giỏ virus trong mẫu bệnh phẩm thấp vỡ khỏng thể trung hoà xuất hiện sớm để
diệt virus; (3) Khú khăn về hậu cần trong việc vận chuyển mẫu - cần vận chuyển mẫu bằng đỏ khụ hoặc bỡnh ni-tơ lỏng; (4) Sự lựa chọn dũng tế bào nhậy để phõn lập virus; (5) Kỹ thuật cỏ nhõn để phõn lập virus. Do vậy, phõn lập được virus VNNB được cho là rất ớt cú khả năng từ cỏc mẫu dịch nóo tuỷ. Nguồn bệnh phẩm phõn lập được virus VNNB cú hiệu quả nhất là mẫu nóo tử thi, tỷ lệ phõn lập được virus VNNB từ mẫu nóo tử thi khoảng 30 %; từ mẫu dịch nóo tuỷ thấp hơn khoảng 3 – 5 %, cũn từ mỏu bệnh nhõn rất thấp, khoảng 0,6 % [38]. Do vậy, chẩn đoỏn VNNB chủ yếu dựa vào kết quả
phỏt hiện khỏng thể đặc hiệu khỏng virus bằng kỹ thuật MAC-ELISA. Tuy nhiờn, những chủng virus VNNB phõn lập được rất cú ý nghĩa để giỏm sỏt dịch tễ học phõn tử cỏc chủng virus VNNB đang lưu hành ở Việt Nam, định hướng cho việc phũng bệnh.
Trong nghiờn cứu này, virus VNNB được phõn lập từ dịch nóo tuỷ của bệnh nhõn ở miền Bắc, miền Trung, nhưng khụng phõn lập được virus
VNNB từ cỏc mẫu dịch nóo tuỷ thu thập ở miền Nam và Tõy Nguyờn. Trờn thực tế, từ những mẫu dịch nóo tuỷ của bệnh nhõn ở Tõy Nguyờn đó phõn lập được virus Banna một loại virus do muỗi truyền thuộc họ Reoviridae từ
dịch nóo tuỷ bệnh nhõn ở Gia Lai, Tõy Nguyờn [8,9]. Cho thấy, nghiờn cứu xỏc định vai trũ gõy bệnh và cỏc loài muỗi là vộc-tơ truyền virus Banna cần
được thực hiện trong những nghiờn cứu tiếp theo.
Ngược lại, virus VNNB được phõn lập từ muỗi, lợn ở tất cả cỏc nơi thu thập mẫu. Kết quả phõn lập được virus VNNB từ muỗi phụ thuộc rất lớn vào thời điểm thu thập mẫu, đặc biệt với cỏc mẫu muỗi thu thập ở miền Bắc, chưa cú cụng bố nào về kết quả phõn lập được virus VNNB vào thời điểm mựa đụng và cuối mựa dịch thỏng 7, 8 ở miền Bắc Việt Nam [4,5,10]. Đối với cỏc mẫu mỏu lợn, kết quả phõn lập dương tớnh chủ yếu từ những mẫu mỏu lợn 2 thỏng tuổi được lấy để phõn lập trước khi cú sự chuyển đổi khỏng thể. Do vậy, việc phõn lập virus VNNB từ mỏu lợn ở lũ mổ hầu như sẽ
khụng cú kết quả dương tớnh, vỡ gần như mỏu lợn ở lũ mổ tỷ lệ cú khỏng thể
khỏng virus VNNB rất cao cú khi lờn đến 100 % [3,5].
Virus VNNB genotyp 1 lần đầu tiờn phỏt hiện ở miền Bắc Việt Nam từ muỗi và lợn trong những năm đầu của thế kỷ 21 [42]. Trờn thực tế, việc phõn lập virus VNNB từ bệnh nhõn là ớt đạt kết quả, do vậy, để nghiờn cứu dịch tễ phõn tử virus VNNB ở Việt Nam, xỏc định sự lưu hành của virus VNNB genotyp 1 ở miền Trung, miền Nam và Tõy Nguyờn, nghiờn cứu phõn tớch trỡnh tự toàn bộ vựng gen E của cỏc chủng virus phõn lập từ muỗi, lợn ở những khu vực này để so sỏnh là một sự lựa chọn duy nhất và cú tớnh khả thi cao.
Cỏc chủng virus VNNB sử dụng để xỏc định trỡnh tự nucleotide được
định loại bằng kỹ ELISA Sandwich để chọn chủng. Để định loại virus, cú một số kỹ thuật thường được sử dụng như kỹ thuật huỳnh quang giỏn tiếp, kỹ thuật ELISA Sandwich, tuỳ từng đặc điểm của mỗi loại virus khỏc nhau
để lựa chọn kỹ thuật định loại cho phự hợp, hiệu quả và khoa học [38]. Đối với virus Dengue, cú 4 typ huyết thanh, kỹ thuật huỳnh quang giỏn tiếp thường được lựa chọn để định loại vỡ nú cú thể sử dụng để định typ huyết thanh. Nhưng đối với virus VNNB, chỉ cú 1 typ huyết thanh duy nhất, kỹ
thuật ELISA Sandwich thường được lựa chọn vỡ nú sử dụng để định loại và rất phự hợp để thực hiện với một số lượng lớn mẫu thử.
Để tỏch chiết vật liệu di truyền của virus, trong nghiờn cứu này sử
dụng phương phỏp tỏch chiết vật liệu di truyền bằng bộ kớt tỏch chiết ARN của QIAGEN, kỹ thuật này cú ưu điểm thời gian thực hiện ngắn hơn, an toàn cho người sử dụng. Mặt khỏc, thể tớch lượng ARN thu được cú thể đủ cho từ
5 – 10 lần lặp lại kỹ thuật RT-PCR từ một mẫu tỏch chiết. Nhưng nếu bằng tỏch chiết bằng phương phỏp hoỏ học, thể tớch lượng ARN thu được chỉ cú thể đủ cho 1 – 2 lần thực hiện kỹ thuật RT-PCR từ một mẫu tỏch chiết. Nếu cần thực hiện kiểm tra nhiều lần bằng kỹ thuật RT-PCR từ một mầu tỏch chiết, phương phỏp này khụng đỏp ứng được. Chớnh vỡ vậy, sử dụng bộ kit QIAGEN để tỏch chiết ARN giỏ thành cao hơn, nhưng an toàn cho người thực hiện kỹ thuật và cho mụi trường; đảm bảo được lượng mẫu cho nghiờn cứu lặp lại, phương phỏp này ngày càng được sử dụng rộng rói [28].
Trong nghiờn cứu này, để khuyếch đại vựng gen E, sử dụng cặp mồi
đặc hiệu với kỹ thuật RT-PCR trực tiếp để trỏnh bị nhiễm chộo trong quỏ trỡnh thực hiện. Kết quả, sử dụng cặp mồi đặc hiệu vựng gen E để khuếch đại
vựng gen này, thu được một band dương tớnh duy nhất đối với mỗi một mẫu, sau khi tinh sạch, kiểm tra lại trờn gel agarose một lần nữa đó khẳng định lại kết quả này (hỡnh 4.2).
5.1.2. Sự tiến hoỏ của virus VNNB dựa trờn trỡnh tự vựng gen E đối với
cỏc chủng virus VNNB phõn lập trong cỏc năm 1988 – 2007.
Giải trỡnh tự, phõn tớch vựng gen E của 34 chủng virus VNNB để xỏc
định sự lưu hành của cỏc genotyp virus VNNB ở Việt Nam được thực hiện bằng bộ kit DTCS Quick Start, sử dụng những mồi ngược và mồi xuụi đặc hiệu được thiết kế trong vựng gen E (inner primer) cú độ dài sản phẩm khoảng 300 – 500 nucleotide để kiểm tra sự trựng lặp về kết quả giải trỡnh tự
vựng gen (nội kiểm tra) đảm bảo tớnh chớnh xỏc. Sự phỏt triển rất nhanh cụng nghệ giải mó gen đó cho phộp giải mó gen những đoạn dài hơn 500 nucleotide. Trước đõy, cụng nghệ này được thực hiện bằng gel polyacrylamide, nhuộm và chụp X. quang đểđọc trỡnh tự cỏc nucleotide của một đoạn gen. Đõy cũng cú thể là một trong những lý do cản trở cỏc nhà khoa học nghiờn cứu những đoạn gen trờn 1000 nucleotide. Do vậy, cỏc nghiờn cứu dịch tễ học phõn tử virus VNNB trước đõy thường sử dụng vựng gen PrM hoặc M là những vựng gen khoảng 500 nucleotide [23,40,54].
Ngày nay, cụng nghệ giải trỡnh tự gen ngày càng phỏt triển với ứng dụng cỏc hệ vi mao quản (capilary) cho phộp đọc giải trỡnh tự gen một lần khoảng 8 mẫu đối với mỏy AB 3.100, hoặc 96 mẫu đối với mỏy CEQTM 8000. Tuy nhiờn, qua thực tế sử dụng, mỗi loại mỏy Sequencing cú tớnh ưu việt và những nhược điểm nhất định, việc sử dụng mỏy CEQTM 8000 giỏ thành sinh phẩm thấp hơn, nhưng cần thực hiện đối với một lượng mẫu thử
Để xỏc định nhanh genotyp của virus cú thể thực hiện theo phương phỏp giải trỡnh tự gen hai đầu bằng mồi xuụi hoặc mồi ngược đặc hiệu. Tuy nhiờn, để xõy dựng cõy phỏt sinh loài, nghiờn cứu sự tiến hoỏ của virus cần phải giải trỡnh từ toàn bộ vựng gen E dài 1500 nucleotide.
Nghiờn cứu dịch tễ học phõn tử virus VNNB trong những năm 90
được thực hiện bởi Chen và cộng sự dựa trờn vựng gen PrM, xỏc định virus VNNB cú 4 genotyp. Trong những nghiờn cứu tiếp theo của Solomon 2003 về dịch tễ học phõn tử virus VNNB dựa trờn vựng gen E đó xỏc định virus VNNB cú 5 nhúm genotyp. Genotyp 1 gồm cỏc chủng virus VNNB phõn lập từ Đụng Nam Á, Australia, Triều Tiờn và Nhật Bản. Genotyp 2 gồm cỏc chủng virus phõn lập từ Malaysia, Indonesia và Australia. Genotyp 3 gồm cỏc chủng virus VNNB phõn lập từ Đụng Nam Á, Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiờn, Đài Loan và tiểu lục địa Chõu Á. Genotyp 4 chỉ cú cỏc chủng virus VNNB phõn lập từ muỗi ở Indonesia và genotyp 5 chỉ cú 1 chủng virus VNNB phõn lập từ chim ở Singapore [18,23,32,34,40,42,50].
Như vậy trong cỏc genotyp virus VNNB, genotyp 1 và 3 được ghi nhận cú lưu hành ở nhiều nước Chõu Á. Trờn thực tế virus VNNB genotyp 3
được phõn lập được từ bệnh nhõn, ổ chứa virus (lợn, chim), muỗi ở nhiều nơi trờn thế giới. Ngược lại, phần lớn cỏc chủng virus VNNB thuộc genotyp 1 được phõn lập từ muỗi và mỏu lợn, cho đến nay chỉ cú 5 chủng virus VNNB thuộc genotyp 1 được phõn lập từ nóo tử thi ở Thỏi Lan trong cỏc năm 1979 và 1984 [42,50].
Trong nghiờn cứu này, dựa trờn kết quả xỏc định genotyp virus VNNB phõn lập ở Việt Nam trong cỏc năm 1988 – 2007, xỏc định cỏc chủng virus
VNNB phõn lập từ muỗi, lợn trong cỏc năm 2001 – 2007 thuộc genotyp 1. Như vậy, virus VNNB genotyp 1 được xỏc định lưu hành rộng rói ở miền Bắc (Hà Tõy), miền Trung (Quảng Bỡnh), miền Nam (Long An, Cần Thơ) và Tõy Nguyờn (Gia Lai) ở muỗi, lợn (hỡnh 4.3). Kết quả nghiờn cứu này phự hợp với một số nghiờn cứu khỏc trờn thế giới và một lần nữa khẳng định VNNB genotyp 1 thớch ứng với muỗi, lợn hơn là người. Nghiờn cứu về dịch tễ học phõn tử virus VNNB trước những năm 1990 xỏc định cỏc chủng virus VNNB phõn lập từ người, từ muỗi, từ lợn và từ chim ở Việt Nam đều thuộc genotyp 3 [23,42]. Như vậy, với sự mới xuất hiện của virus VNNB genotyp 1, ở Việt Nam đang lưu hành cả hai genotyp virus VNNB là genotyp 1 và genotyp 3 (hỡnh 4.5). Do khụng thực hiện giải trỡnh tự gen toàn bộ cỏc chủng virus VNNB phõn lập từ muỗi và lợn mà chỉ chọn một số lượng rất ớt cỏc chủng phõn lập được, nờn khụng thể xỏc định được tỷ lệ mang virus VNNB genotyp 1 và genotyp 3 như thế nào trong quần thể muỗi.
Sự mới xuất hiện virus VNNB genotyp 1 ở một số nước vựng cận nhiệt đới ở chõu Á trong những năm gần đõy như Nhật Bản, Triều Tiờn, Việt Nam cú thể là do chim di cư mang virus, chỳng là ổ chứa và là nguồn lõy truyền virus sang muỗi trong tự nhiờn. Chớnh vỡ vậy từ những năm 2003, khi nghiờn cứu về sự tiến hoỏ của virus VNNB ở chõu Á, Solomon và cộng sự
cho rằng vựng Đụng Nam chõu Á cú thể là vựng tiềm tàng lưu hành nhiều loại virus chưa được phỏt hiện, là vựng trọng điểm xuất hiện những căn nguyờn mới trờn thế giới [17,35,46,47,65,66]. Virus VNNB lan rộng trong vài thập kỷ gần đõy, tuy nhiờn lý do của sự lan rộng đến những khu vực mới này cũng chưa được sỏng tỏ, cú giả thiết cho rằng cú thể do chim di cư mang virus tới hoặc do muỗi Cx. Tritaeniorhynchus cú thể bay rất xa trong những
trong một vài trường hợp nào đú vớ dụ như sự xuất hiện một số lượng muỗi mang virus trờn những tầu thuỷ hoặc mỏy bay giữa vựng Nam Á và Đụng Á cũng cú thể gúp phần làm phỏt tỏn virus VNNB từ vựng này đến vựng khỏc [46,65]. Điều này cũng đú được đề cấp tới như sự mới xuất hiện và lan rộng của virus Tõy sụng Nil ở Hoa Kỳ trong những năm gần đõy [44]. Sự lõy lan virus từ vựng này đến vựng khỏc bởi chim di cư nhiễm virus huyết là sự giải thớch hợp lý hơn cả.
Hỡnh 5.1. Đường di cư của chim từ Chõu Á tới Đại Tõy dương [42] Tuy nhiờn, cho đến nay vẫn chưa phõn lập được virus VNNB từ
những loài chim di cư để làm bằng chứng khoa học khẳng định cho giải thiết này. Do vậy, cần cú nghiờn cứu phỏt hiện virus VNNB từ một số loài chim di cư hoặc chim hoang dại để chứng minh cho giả thiết trờn.
Mongolia China Japan Indonesia Philippines Malaysia Australia Thai Korea Cambodia Vietnam
Kết quả phõn tớch sự tiến hoỏ của cỏc chủng virus VNNB khụng chỉ
phự hợp với cỏc chủng virus VNNB genotyp 1 mà cũng phự hợp với cả cỏc chủng virus VNNB genotyp 3 về tớnh tương đồng của vật liệu di truyền đối với cỏc chủng virus VNNB được phõn lập ở những vựng địa lý khỏc nhau, trong những khoảng thời gian gần nhau. Vớ dụ, những chủng virus phõn lập trong cỏc khoảng thời gian gần nhau từ Việt Nam, Nam Triều Tiờn hoặc Nhật Bản cú liờn quan rất gần giữa chủng với nhau trong cựng một genotyp (hỡnh 4.4). Trong nghiờn cứu này, trỡnh tự vựng gen E của cỏc chủng virus VNNB phõn lập ở Việt Nam trong cỏc thập kỷ 60, 70 và 80 được xỏc định thuộc nhúm genotyp 3. Chớnh vỡ vậy cỏc chủng Nakayama của Nhật Bản, Beijing-1 và SA 14 của Trung Quốc hiện đang được sử dụng để sản xuất vắc-xin VNNB phũng bệnh ở Việt Nam cũng như trờn thế giới [7,21,23,26,29,37,39].
5.2. Xỏc định vai trũ gõy bệnh của virus VNNB genotyp 1