3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1 Thiết kế nghiờn cứu
3.3.2.Quy trỡnh kỹ thuật
3.3.2.1. Quy trỡnh kỹ thuật thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm
Quy trỡnh kỹ thuật thu thập và bảo quản mẫu dịch nóo tuỷ: Dịch nóo tuỷ để phõn lập virus VNNB được thu thập trong 5 ngày đầu sau phỏt bệnh, lấy khoảng 2 ml (do bỏc sỹ điều trị lấy), bảo quản ở điều kiện - 800C; mẫu được chuyển về phũng thớ nghiệm bằng đỏ khụ hoặc bỡnh ni-tơ lỏng và được giữ ở
- 800C cho đến khi phõn lập.
Quy trỡnh kỹ thuật thu thập và bảo quản mẫu mỏu lợn: Mỏu lợn được lấy từ lợn 2 thỏng tuổi, mỗi tuần thu thập mỏu lợn 1 lần. Mỏu lợn được chia ra làm 2 tuýp: 1 tuýp lưu giữ ở 40C, tỏch lấy huyết thanh phỏt hiện khỏng thể ức chế ngưng kết hồng cầu khỏng virus VNNB để sàng lọc xỏc định những mẫu trước khi cú chuyển đổi khỏng thể; 1 tuýp được lưu giữ ở - 800C, sau khi cú kết quả sàng lọc xỏc định những mẫu trước khi cú chuyển đổi khỏng thể, chọn và lưu giữ những mẫu này để phõn lập virus VNNB.
Quy trỡnh thu thập, định loại và bảo quản mẫu muỗi: Muỗi được thu thập
ở miền Bắc; ở miền trung, miền Nam và Tõy Nguyờn, muỗi được thu thập ở
những nơi cú bệnh nhõn VNNB. Muỗi được bắt trong nhà, trong chuồng gia sỳc gần nhà, thời gian bắt muỗi từ 6 giờ đến 9 giờ tối. Muỗi được bắt bằng bẫy, hoặc bằng vợt. Muỗi thu thập được chuyển sang lồng lưu giữ muỗi, bảo quản trong điều kiện cú đủ độ ẩm, dinh dưỡng trong quỏ trỡnh vận chuyển. Muỗi thu thập tiờu hết mỏu trong dạ dầy, định loại muỗi tại phũng thớ nghiệm Cụn trựng của Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ương và cỏc Viện khu vực dựa theo đặc điểm hỡnh thể ngoài theo khoỏ định loại của CDC. Cỏc cỏ thể muỗi cựng loài được hộn thành một mẫu để trong tuýp loại 1,8 ml, mỗi mẫu muỗi cú khoảng 20 đến 60 cỏ thể muỗi. Tuýp đựng muỗi cần ghi đầy đủ
3.3.2.2. Phõn lập và định loại virus VNNB theo quy trỡnh chuẩn thức phũng thớ nghiệm
Virus VNNB được phõn lập bằng tế bào Aedes albopictus dũng C6/36. Mẫu bệnh phẩm sau khi xử lý được gõy nhiễm tế bào C6/36 một lớp được nuụi cấy trờn chai nhựa nuụi cấy tế bào loại 25 cm2. Sau 4- 5 ngày, kiểm tra nước nổi tế bào gõy nhiễm bệnh phẩm bằng kỹ thuật ELISA Sandwich để
phỏt hiện virus hoặc khỏng nguyờn virus. Những mẫu xỏc định dương tớnh bằng kỹ thuật ELISA Sandwich được lưu giữ và cấy truyền lần thứ hai, lấy nước nổi để tỏch chiết vật liệu di truyền để khuyếch đại vựng gen E.
Đối với những chủng virus đó phõn lập trong những năm trước đõy, cần cấy chuyển lại chủng virus trờn tế bào Aedes albopictus dũng C6/36, sau 4 – 5 ngày, thu hoạch nước nổi, lấy mẫu tỏch chiết vật liệu di truyền cho kỹ
thuật sinh học phõn tử.
Bệnh phẩm
ổchứa
(máu lợn, não chim, cò)
Vec tơ
(Các loài muỗi Culex…) Bệnh nhân
(não tử thi, dịch não tuỷ)
Xử lý Phân lập virus
(chuột ổ, trên tế bào)
Phát hiện vật liệu di truyền của virus Bằng kỹ thuật RT-PCR Xác định virus bằng kỹ thuật ELISA Sandwich Xác định genotyp Bằng kỹ thuật sequencing
3.3.2.4. Quy trỡnh giải trỡnh gen từ mẫu virus VNNB
Sơ đồ 3.2. Túm tắt sơ đồ thực hiện giải trỡnh tự gen virus VNNB
Mẫu virus VNNB đó sàng lọc
Tinh sạch sản phẩm RT-PCR
Thực hiện phản ứng RT-PCR để nhõn đoạn gen đặc hiệu
Tỏch chiết ARN của vius
Tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR giải trỡnh tự Thực hiện phản ứng PCR giải trỡnh tự Đọc trỡnh tự của vựng gen trờn mỏy CEQ 8000
Kiểm tra chất lượng
Xỏc định độ tinh sạch và nồng độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Điện di kiểm tra
Xỏc định nồng độ 1 2 3 4 5 6
Quy trỡnh giải mó gen virus được thực hiện tại phũng thớ nghiệm virus Viờm nóo/Arbo, Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương. Trong quỏ trỡnh thực hiện kỹ thuật từ giai đoạn tỏch chiết vật liệu di truyền đến cỏc giai đoạn tiếp theo như tinh sạch sản phẩm PCR, làm khuụn để thực hiện phản ứng PCR giải trỡnh tự và tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR giải trỡnh tự được kiểm tra bằng điện di trờn gel và bằng mỏy quang phổ để xỏc định hàm lượng ARN/ADN.
Kỹ thuật tỏch chiết vật liệu di truyền ARN
Nguyờn lý kỹ thuật: Sử dụng một dung dịch AVL (cú chất mang ARN) để ly giải virus, khi cho mẫu cần tỏch chiết ARN vào dung dịch AVL, virus nếu cú trong mẫu sẽ bị ly giải, ARN của virus sẽ được gắn vào chất mang ARN. Với sự cú mặt của cồn 100%, ARN của virus sẽ bị tủa. Khi cho lọc qua màng QIA amp Silicagel, ARN của virus sẽ được gắn chọn lọc trờn màng QIA amp Silicagel nhờ chất mang ARN. Sử dụng dung dịch rửa AW1, AW2
để loại cỏc thành phần tạp bỏm trờn màng QIA amp Silicagel. Dung dịch chiết xuất AVE sẽ tỏch ARN của virus bỏm trờn màng QIA amp Silicagel. Cỏc bước thực hiện kỹ thuật theo hướng dẫn của nhà sản xuất:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch ly giải AVL cú chứa chất mang ARN theo thường quy đi kốm bộ sinh phẩm.
Bước 2: Cho 140 àl mẫu vào tuýp eppendorf cú 560 àl dung dịch ly giải AVL cú chất mang ARN, trộn bằng mỏy trộn (mỏy Vortex) khoảng 15 giõy,
để tạo một hỗn dịch đồng nhất giữa mẫu và dung dịch AVL. Ủ ở nhiệt độ
phũng (15-250C) trong 10 phỳt, đảm bảo cỏc hạt virus bị ly giải hoàn toàn, khi virus bị ly giải ARN được gắn vào chất mang ARN, ly tõm 8.000 vũng/phỳt trong 3 giõy để chuyển cỏc giọt dớnh trờn nắp và thành tuýp xuống.
Bước 3: Cho 560 àl ethanol 100% vào tuýp eppendoff trờn, trộn đều bằng mỏy trộn trong vũng 15 giõy, ethanol sẽ tủa cỏc sợi ARN lại. Sau đú ly tõm ly tõm 8.000 vũng/phỳt/ 3 giõy để chuyển cỏc giọt dớnh trờn nắp và thành tuýp xuống.
Bước 4: Chuẩn bị cột QIA amp spin được đặt vào tuýp 2 ml (collection tube). Cho 630 àl (một nửa số mẫu trờn) vào cột QIA amp spin, ly tõm 8.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt. Tất cả ARN sẽ được gắn trờn bề mặt màng Silicagel với sự cú mặt của chất mang ARN, loại bỏ phần dịch lọc trong tuýp 2 ml,
đặt cột QIA amp spin vào tuýp 2 ml.
Bước 5: Cho nốt phần mẫu cũn lại (630 àl) vào cột QIA amp spin trờn, ly tõm 8.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt. Đổ phần dịch lọc trong tuýp 2 ml, đặt cột QIA amp spin vào tuýp 2 ml.
Bước 6: Cho 500 àl dung dịch rửa AW 1 cú chứa ethanol 100% vào cột QIA apm spin, ly tõm 8.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, để loại bỏ cỏc thành phần khụng phải là ARN cú trờn mặt màng Silicagel. Đổ phần dịch lọc trong tuýp 2 ml, đặt cột QIA amp spin vào tuýp 2 ml.
Bước 7: Cho 500 àl dung dịch rửa AW 2 cú chứa ethanol 100% vào cột QIA apm spin, ly tõm 14.000 vũng/phỳt trong 3 phỳt, để loại bỏ cỏc thành phần khụng phải là ARN cú trờn mặt màng Silicagel. Loại bỏ tuýp 2 ml cú chứa dịch lọc, đặt cột QIA amp spin vào tuýp 2 ml mới.
Bước 8: Ly tõm 14.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt đểđảm bảo loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa.
Bước 9: Chuyển cột QIA amp spin vào tuýp eppendorf sạch 1.5 ml. Mở rất nhẹ nhàng nắp cột QIA amp spin, cho 60 àl dung dịch AVE. Đậy nắp để ở
nhiệt độ phũng 1 phỳt, sau đú ly tõm 8.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt. Tất cả
dung dịch khụng cú Rnase, cú chứa 0,04% sodium azide. Khi ly tõm toàn bộ
ARN của mẫu sẽ được thu hồi trong dịch lọc đựng trong tuýp eppendorf sạch 1.5 ml.
ARN sau tỏch chiết cú thể được lưu giữ ở –20oC hoặc –70oC trong khoảng 1 năm.
Kỹ thuật RT-PCR trực tiếp
Nguyờn lý: Kỹ thuật RT-PCR trực tiếp là sự khuếch đại trỡnh tự ARN của virus với cặp mồi đặc hiệu của virus khi cú mặt đồng thời 3 enzym là Reverse transcriptase (RTse), ADN polymerase và Rnase H cựng với sự cú mặt của ion Magờ và dNTP. Trong toàn bộ quỏ trỡnh, ARN của virus được chuyển đổi một lần thành cDNA với sự cú mặt của enzyme RTse. Tiếp đú cDNA được khuếch đại hàng nghỡn lần bởi enzyme chịu nhiệt ADN polymerase, sự nhõn lờn của ARN virus bị ức chế bởi enzyme Rnase H. Sản phẩm khuếch đại của phản ứng RT-PCR được khẳng định và kiểm tra bằng phương phỏp chạy điện di trờn gel agarose.
Cụng thức cho một phản ứng RT-PCR trực tiếp Thành phần của kớt (loạt số:………) Nồng độ ban đầu Nồng độ Cuối cựng 1 tube H2O ppi 19.5 àl Reaction Buffer 5 x 1 x 5 àl MgSO4 25 mM 5 àl dNTP Mix 2.5 mM 8 àl
Forward primer (mồi xuụi) 50 àM 0.4 àM 0.5 àl Reverse primer (mồi ngược) 50 àM 0.4 àM 0.5 àl Prime Rnase Inhibitor 40 U/àl 0.2 U/àl 0.5 àl
AMV Reverse Transcriptase 0.5 àl
TfI DNA Polymerase 0.5 àl
Tổng 40 àl
10 àl ARN đó tỏch chiết + 40 àl hỗn hợp trờn ( Mix) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chu trỡnh nhiệt cho phản ứng RT-PCR
Nhiệt độ (0C) (Phỳt:giõy) Thời gian Số lượng chu kỳ
500 C 940 C 30:00 05:00 940 C 640 C 720 C 00:45 00:45 01:30 ……… ……… ……… x 35 720 C 10:00 100C Kết thỳc
Kỹ thuật kiểm tra sản phẩm PCR
Nguyờn lý: Dựa vào đặc tớnh cấu trỳc của cỏc axit nucleic là cỏc đại phõn tử
tớch điện õm, dưới tỏc động của điện trường chỳng sẽ di chuyển về cực dương. Điện di là quỏ trỡnh chuyển phõn tử tớch điện trong dung dịch, sử
dụng một điện trường chạy qua. Trong điện trường cỏc phõn tử tớch điện di chuyển với một tốc độ khỏc nhau phụ thuộc vào điện tớch, hỡnh dạng, kớch thước của nú và đặc tớnh sàng lọc của gel. Kớch thước lỗ, đặc tớnh sàng lọc của gel agarose được xỏc định bằng sựđiều chỉnh nồng độ agarose để tạo gel. Với nồng độ agarose càng cao, kớch thước lỗ gel càng nhỏ. Do vậy, tuỳ theo
độ dài của sản phẩm PCR để chọn nồng độ gel agarose phự hợp.
Cỏc axit nucleic khi di chuyển trong gel agarose sẽ được phỏt hiện dưới tia tử ngoại (UV) theo nguyờn lý hoỏ phỏt quang (chemilluminescense) nhờ một chất phỏt quang Ethidium bromide; Thụng thường sản phẩm PCR
được kiểm tra trờn gel agaroses 1,5 % cú chứa 0,05 % Ethidium bromide chạy trong điện trường 100 V/40- 60 phỳt. Ethidium bromide được gắn xen giữa cỏc base của axit nucleic trong quỏ trỡnh chạy điện di.
Kết quả nhận định dựa trờn kết quả so sỏnh với thang chuẩn, mẫu chứng dương, mẫu chứng õm. Thu hoạch sản phẩm PCR để tinh sạch cho kỹ
thuật giải trỡnh tự gen ở bước tiếp theo.
Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng bộ kớt QIAquick Gel Extraction Kit của QIAGEN. Quy trỡnh kỹ thuật thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm.
Bước 1: Thu hồi sản phẩm ADN từ thạch agarose bằng cỏch sử dụng đốn UV để định dạng vị trớ của sản phẩm trờn thạch agarose, dựng dao mỏng cắt
đoạn thạch agarose cú chứa sản phẩm PCR, cho vào tuýp ly tõm 1,8 ml (microcentrifuge) khụng màu.
Bước 2: Xỏc định trọng lượng thạch cú chứa sản phẩm PCR (Trọng lượng của tuýp cú chứa thạch agarose trừ đi trọng lượng của tuýp khi chưa cú thạch agarose). Cho 3 thể tớch Buffer QG (chuẩn bị theo hướng dẫn) vào 1 thể tớch thạch agarose (cỏch tớnh theo cụng thức 1 g ≈ 100 ml).
Bước 3: Ủ ở nhiệt độ 500C trong thời gian 10 phỳt (cho đến khi thạch agarose tan hoàn toàn). Trong quỏ trỡnh ủ thỉnh thoảng lắc nhẹ hoặc cú thể
trộn bằng mỏy Vortexing sau 2 - 3 phỳt ủ.
Bước 4: Sau khi thạch agarose đó tan hoàn toàn, kiểm tra lại màu của dung dịch (cú màu vàng gần giống với dung dịch QG, nếu khụng phải chỉnh lại pH bằng dung dịch Sodium Acetate 3M, pH=5,0).
Bước 5: Cho 1 thể tớch dung dịch Ethanol - Isopropanol nguyờn chất vào tuýp trờn.
Bước 6: Lắp cột QIAquick spin vào tuýp 2 ml cung cấp trong bộ kớt.
Bước 7: Hỳt toàn bộ dung dịch cú chứa ADN trong tuýp ở trờn cho vào cột QIAquick spin và ly tõm ở 13.000 vũng/1 phỳt.
Bước 8: Loại bỏ dung dịch ly tõm và đặt cột QIAquick spin vào tuýp 2 ml tương tự như trờn.
Bước 9: Cho 0,5 ml dung dịch QG vào cột QIAquick spin và ly tõm ở
Bước 10: Cho 0,75 ml dung dịch PE vào cột QIAquick spin và ly tõm ở
13.000 vũng/1 phỳt.
Bước 11: Loại bỏ dung dịch ly tõm, đặt cột QIAquick spin vào tuýp 2ml và ly tõm thờm 1 phỳt ở 13.000 vũng/1 phỳt.
Bước 12: Đặt cột QIAquick spin vào tube ly tõm 1,8 ml vụ trựng. Để thu toàn bộ lượng ADN tinh khiết, cho 50 àl dung dịch EB vào chớnh giữa cột QIAquick spin, giữ thẳng đứng trong thời gian 1 phỳt, ly tõm ở 13.000 vũng/1 phỳt. [Để tăng khả năng thu hồi lại so với lượng ADN ban đầu, hỳt 30 àl dung dịch cú chứa ADN sau khi đó ly tõm trở lại cột QIAquick spin,
để thẳng đứng trong 1 phỳt và ly tõm ở 13.000 vũng/1 phỳt.] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 13: Kiểm tra lại sản phẩm DNA tinh khiết trờn thạch agarose 1.5%.
Phản ứng PCR để giải trỡnh tự gen sử dụng DTCS Quick Start Kit
Sản phẩm tinh sạch của đoạn gen E dài 1500 nucleotide làm khuụn, để
thực hiện phản ứng PCR giải trỡnh tự gen bằng cỏc mồi đặc hiệu được thiết kế trong vựng gen E. Cỏc sản phẩm PCR giải trỡnh tự gen cú đặc điểm hơn hoặc kộm nhau một nucleotide.
Chuẩn bị phản ứng trong tuýp PCR 0,2 ml hoặc đĩa 96 giếng với cụng thức cho một phản ứng như sau:
Thành phần Cho một phản ứng
1. DTCS Quick Start Master Mix 8 àl
2. ADN/ cDNA khuụn 0,5 – 10,0 àl
3. Mồi đặc hiệu (1,6 pmol/àl hoặc 1,6 àM) 2,0 àl 4. dH2O (đểđiều chỉnh tổng thể tớch phản ứng
đạt đến 20 àl)
9,5 – 0 àl
* Tớnh toỏn lượng ADN/ cDNA khuụn
Tỷ lệ mol giữa mồi và khuụn là > 40 : 1.
Lượng ADN cần dựng cho 1 phản ứng được thể hiện trong bảng sau:
dsDNA (ADN sơi kộp) 50 – 100 pmol ssDNA (ADN sợi đơn) 25 – 50 pmol Sản phẩm PCR tinh sạch 25 – 100 pmol Chương trỡnh chạy PCR giải trỡnh tự 960C 20 giõy 500C 20 giõy 600C 4 phỳt 30 chu kỳ Giữ ở 100C Kết thỳc
Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm PCR giải trỡnh tự gen
Sản phẩm PCR giải trỡnh tự gen được tinh sạch để loại bỏ cỏc thành phần thừa bằng phương ethanol, là phương phỏp đơn giản, dễ sử dụng và tiết kiệm chi chớ.
Bước 1: Chuẩn bị tuýp 0,5 ml (đó khử trựng, số lượng ống tương đương với số lượng mẫu cần tinh sạch).
Bước 2: Thờm vào mỗi tuýp 0,5 ml hỗn hợp dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) với cỏc thành phần và thể tớch như sau:
3M Natri Acetate pH 5,2 2 àl 100mM Na2EDTA pH 8,0 2 àl 20mg/ml Glycogen (Cung cấp kốm
theo DTCS Quick Start Kit)
1 àl
Bước 3: Chuyển toàn bộ dung dịch phản ứng PCR giải trỡnh tự vào tuýp loại 0,5 ml đó cú hỗn hợp dung dịch dừng (Stop Solution) và lắc bằng vortex trong vài giõy.
Bước 4; Thờm vào mỗi tuýp 60 àl ethanol lạnh 95% (ethanol để ở – 200C), lắc bằng vortex và ly tõm với tốc độ 14.000 vũng/ phỳt trong 15 phỳt ở 40C. Hỳt bỏ dung dịch nhẹ nhàng giữ lại sản phẩm PCR giải trỡnh tự ởđỏy tuýp. Bước 5: Rửa sản phẩm PCR giải trỡnh tự bằng cỏch thờm 200 àl ethanol lạnh 70% (ethanol để ở - 200C) và ly tõm với tốc độ 14.000 vũng/ phỳt trong 2 phỳt ở 40C, hỳt bỏ dung dịch nhẹ nhàng.
Bước này được thực hiện 2 lần
Bước 6: Quay khụ chõn khụng trong vũng 10 phỳt.
Bước 7: Làm đồng nhất sản phẩm PCR giải trỡnh tự trong 40 àl SLS (cung cấp kốm theo DTCS Quick Start Kit).
Chuẩn bị mẫu để đặt vào mỏy giải trỡnh tự gen
Bước 1: Chuyển toàn bộ dung dịch đồng nhất sản phẩm PCR giải trỡnh tự
trong 40 àl SLS từ bước tinh sạch vào giếng tương ứng trờn đĩa chạy mẫu (Sample plate). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 2: Nhỏ một giọt dầu (mineral oil) lờn trờn để trỏnh mẫu bị bay hơi. Bước 3: Đặt đĩa vào mỏy Sequencing, tối ưu hoỏ cỏc thụng số của mỏy, cài