II. COLIFORMS VĂ ESCHERICHIA COL
2.2.2. Môi trường vă hoâ chất
- Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate) - Môi trường lỏng Brilliant Green Lactoase Bila Salt (canh BGBL) - Môi trường lỏng E. coli (E. coli medium, canh EC)
Câc môi trường lỏng trín được chuẩn bị trong câc ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ thị sử dụng câc ống nghiệm không có bọt khí bín trong ống Durham.
- Canh Tryptone
- Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (Thạch simmon Citrate) - Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water) - Thuốc khử Kovac’s
- Canh MR-VP
- Thuốc thử Methyl Red - Thuốc thử a-napthol
2.2.3. Quy trình phđn tích
Chuẩn bịđồng nhất mẫu hoặc pha loêng mẫu để có dịch mẫu có độ pha loêng 10-1.
a. Định lượng Coliforms
Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đê pha loêng 10-1 văo 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu pha loêng 10-2 vă 10-3. Đđy lă trường hợp xâc định MPN bằng hệ số 3 độ nồng độ vă 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 x 3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms trong mẫu quâ cao, phải sử dụng câc mẫu có độ pha loêng cao hơn. Ủ câc ống nghiệm ở 370C trong 48 giờ. Ghi nhận : ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng (khuyín cấy) cấy chuyển dịch mẫu câc ống LSB (+) sang câc ống chứa canh BGBL vă ủ ở 370C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết quả (+) (có sinh hơi)
ứng với mỗi pha loêng.
b. Định lượng Coliforms chịu nhiệt
Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ câc ống canh LSB sang môi trường canh EC, ủ ở 44,50C ± 0,20C trong 24 giờ. Đếm số lượng câc ống cho kết quả (+) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loêng.
c. Định lượng Coliforms phđn
Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ câc ống (+) trín môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ câc đĩa năy ở 370C trong 24 giờ. Câc khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa vă có ânh kim tím lă khuẩn lạc của Coliforms phđn hay E. coli giảđịnh. Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn1mm vă cấy văo canh Trypton,
ủ ở 44,5 ± 0,2oC trong 24 giờ. Nhỏ thuốc thử Kovac’s văo câc ống nghiệm. Ống nghiệm có sự xuất hiện mău đỏ trong môi trường trong văi phút lă ống (+). Thực hiện tương tự cho câc ống (-) trín môi trường EC. Ghi nhận số lượng câc ống cho kết quả (+) trín môi trường Trypton tương ứng với mỗi độ pha loêng.
d. Định lượng E.coli
Trước tiín thực hiện tương tự như trường hợp định lượng Coliforms phđn như trín. Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ câc ống (+) trín môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ câc đĩa năy ở 370C trong 24 giờ để tìm câc khuẩn lạc E. coli giảđịnh (tròn, dẹt hình đĩa vă có ânh kim tím). Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm vă cđý văo câc môi trường MRVP, Simmom Citrate Aga để thực hiện câc thử nghiệm IMViC. Khuẩn lạc E.coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự lă ++-- chính lă E. coli. Ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC vă khuẩn lạc E.coli giả định trín môi trường EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC như trín lă ống nghiệm E.coli (+). Thực hiện tương tự cho tất cả câc ống nghiệm cho kết qủa (+) trong môi trường EC vă tạo
được khuẩn lạc E.coli giả định trín môi trường EMB. Ghi nhận số lượng câc
ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loêng của mẫu.