2. Chương 4: Kết quả và bàn luận:
2.1. Khảo sát chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp pectinase có hoạt tính cao nhất:
cao nhất:
Cách thực hiện:
3 loài nấm mốc A. niger, A. oryzae, A. awamori được nuôi cấy trong môi trường có thành phần xác định như mục 3.1.4.
Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt là 300C, tốc độ lắc là 125 vòng/phút.
Chúng tôi tiến hành lấy mẫu enzyme tại các thời điểm sau: 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 giờ nuôi cấy.
Để khảo sát hoạt tính của endo-polygalacturonase, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích được trình bày ở mục 3.3.1.1.
Để khảo sát hoạt tính của exo-polygalacturonase, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích được trình bày ở mục 3.3.1.2.
Kết quả:
Bảng 4.1: Sự thay đổi hoạt tính endo-polygalacturonase (UI/ml) trong canh trường nuôi cấy nấm mốc theo thời gian.
Loài nấm
mốc 12 24 36 Thời gian nuôi cấy (giờ)48 60 72 84 96 108 120
A. awamori 0,038 0,036 0,085 0,183 0,206 0,210 0,215 0,183 0,022 0,014
A. niger 0,045 0,064 0,109 0,154 0,154 0,191 0,217 0,205 0,216 0,073
Hình 4.1:Sự thay đổi hoạt tính endo-polygalacturonase trong canh trường nuôi cấy nấm mốc theo thời gian.
Bảng 4.2: Sự thay đổi hoạt tính exo-polygalacturonase (UI/ml) trong canh trường nuôi cấy nấm mốc theo thời gian.
Loài nấm
mốc 12 24 36 48Thời gian nuôi cấy (giờ)60 72 84 96 108 120
A. awamori 0,063 0,132 0,189 0,532 0,646 0,714 0,477 0,372 0,191 0,098
A. niger 0,144 0,187 0,237 0,304 0,477 0,511 0,686 0,418 0,224 0,030
A. oryzae 0,064 0,117 0,144 0,338 0,480 0,517 0,791 0,705 0,271 0,172
Hình 4.2: Sự thay đổi hoạt tính exo-polygalacturonase trong canh trường nuôi cấy nấm mốc theo thời gian.
Từ hình 4.1 chúng tôi có những nhận xét sau:
Trong giai đoạn đầu (0-12 giờ), sự sinh tổng hợp endo- polygalacturonase của cả 3 loài nấm mốc tương đối thấp, hoạt tính enzyme trong canh trường không vượt quá 0,05UI/ml.
Sau 12 giờ, hoạt tính enzyme thu được tăng nhanh trong canh trường nuôi cấy. Đối với A. awamori, hoạt tính enzyme đạt 0,206UI/ml sau 60 giờ nuôi. Từ giờ nuôi cấy thứ 60 đến 84, hoạt tính enzyme tăng chậm, hoạt tính cực đại là 0,215 UI/ml sau 84 giờ nuôi. Đối với hai loài A. niger và A. oryzae, hoạt tính enzyme cực đại thu được là 0,217UI/ml sau các thời gian nuôi cấy tương ứng là 84 và 96 giờ.
Sau 84 giờ đối với A. awamori, A. niger và sau 96 giờ đối với A. oryzae, hoạt tính endo-polygalacturonase trong 3 canh trường đều giảm rất nhanh.
Từ hình 4.2 chúng tôi có những nhận xét sau:
Trong giai đoạn từ 0-12 giờ, hoạt tính của exo-polygalacturonase thu được trong 3 canh trường khá thấp. Nếu chỉ xét trong giai đoạn thích nghi, A. niger
cho enzyme có hoạt tính cao hơn so với 2 loài còn lại, chứng tỏ A. niger thích nghi với môi trường nhanh hơn.
Đối với A. awamori, trong giai đoạn từ giờ nuôi cấy thứ 36 đến 72, hoạt tính enzyme trong canh trường tăng nhanh và đạt cực đại là 0,714UI/ml sau 72 giờ nuôi. Sau đó, hoạt tính enzyme giảm mạnh.
Đối với A. niger, hoạt tính exo-polygalacturonase trong canh trường tăng dần theo thời gian nuôi cấy và đạt giá trị cao nhất là 0,686UI/ml sau 84 giờ nuôi. Sau đó hoạt tính của enzyme cũng giảm nhanh.
Quá trình sinh tổng hợp exo-polygalacturonase ở A. oryzae cũng tương tự như ở A. niger: theo thời gian hoạt tính enzyme trong canh trường tăng dần đến cực đại là 0,791 UI/ml sau 84 giờ nuôi. Sau đó, hoạt tính của enzyme cũng bị giảm đi.
Bàn luận:
Thời gian đầu của quá trình nuôi cấy (0-12 giờ) là thời gian để nấm mốc thích nghi với môi trường mới. Vì vậy, lượng enzyme pectinase chưa được sinh ra nhiều, hoạt tính enzyme thu được trong canh trường khá thấp.
Theo lý thuyết, sau khi đã thích nghi với môi trường, nấm mốc bắt đầu phát triển và tăng sinh khối. Các tế bào không ngừng tiết ra enzyme pectinase để thủy phân pectin-là nguồn carbon duy nhất trong môi trường nhằm mục đích tạo ra chất dinh dưỡng để chúng sử dụng. Vì thế, hoạt tính enzyme thu được trong canh trường tăng nhanh.
Sau khi đạt được giá trị cực đại, hoạt tính endo và exo- polygalacturonase trong các canh trường bị giảm xuống. Có lẽ theo thời gian, hàm lượng các chất dinh dưỡng trong canh trường giảm dần, do đó quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp pectinase ở nấm mốc cũng bị giảm theo. Ngoài ra, một số phân tử pectinase được sinh ra trong canh trường cũng có thể bị giảm hoạt tính theo thời gian.
Khi sử dụng chế phẩm pectinase nhằm mục đích làm giảm độ nhớt của dịch quả, tăng hiệu suất thu hồi chất chiết từ quả, chế phẩm endo- polygalacturonase sẽ cho hiệu quả tốt hơn so với chế phẩm exo-polygalacturonase. Do đó, trong những thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy nấm mốc sao cho hoạt tính của endo-polygalacturonase thu được trong canh trường là cao nhất.
Chúng tôi nhận thấy chỉ sau 60 giờ nuôi cấy, A. awamori cho endo- polygalacturonase có hoạt tính khá cao (0,206 UI/ml). Giá trị này nhỏ hơn 4,2% so với giá trị cực đại là 0,215 UI/ml sau 84 giờ nuôi. Khi so sánh với hoạt tính cực đại của A. niger và A. oryzae (0,217UI/ml), giá trị này nhỏ hơn 5%. Tuy nhiên, thời gian nuôi cấy 2 loài A. niger và A. oryzae để hoạt tính endo-polygalacturonase đạt giá trị cực đại lại kéo dài đến 84 giờ và 96 giờ. Thời gian nuôi cấy dài là một nhược điểm lớn trong thực tiễn vì làm tăng chi phí năng lượng và giảm năng suất sản xuất của nhà máy.
Trên cơ sở đó, chúng tôi chọn loài A. awamori để nghiên cứu tiếp. Thời gian nuôi cấy để thu nhận enzyme được chọn là 60 giờ. Khi đó, hoạt tính của endo-polygalacturonase gần bằng giá trị cực đại, còn hoạt tính exo- polygalacturonase là 0,646 UI/ml (giá trị này bằng 90% so với giá trị cực đại 0,714 UI/ml sau 72 giờ nuôi).
2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến hoạt tính pectinase:
Cách thực hiện:
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng loài nấm mốc A. awamori và thời gian nuôi cấy là 60 giờ.
Để khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng pectin lên hoạt tính của pectinase, chúng tôi thay đổi hàm lượng pectin trong môi trường nuôi cấy như sau: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 g/l. Những thành phần khác của môi trường sẽ được giữ cố định như trong mục 3.1.4.
Nhiệt độ nuôi cấy là 300C và tốc độ lắc là 125 vòng/phút.
Hoạt tính của endo-polygalacturonase được xác định theo phương pháp phân tích trình bày trong mục 3.3.1. Thí nghiệm được thực hiện 2 lần và lấy kết quả trung bình.
Kết quả thí nghiệm:
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến hoạt tính endo-polygalacturonase. Hàm lượng pectin (%w/v) Hoạt tính enzyme(UI/ml)
5 0,211 10 0,220 15 0,224 20 0,212 25 0,213 30 0,211 35 0,176 40 0,156 45 0,159
Hình 4.3: Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến hoạt tính endo-polygalacturonase. Nhận xét:
Từ hình 4.3, ta nhận thấy: Khi tăng hàm lượng pectin trong môi trường nuôi cấy từ 5g/l đến 15g/l, hoạt tính endo-polygalacturonase tăng nhẹ từ 0,211 đến 0,224 UI/ml.
Nếu ta tiếp tục tăng nồng độ pectin trong môi trường từ 15g/l đến 30g/l, hoạt tính endo-polygalacturonase thu được trong canh trường bị giảm nhẹ từ 0,224 UI/ml xuống 0,211 UI/ml
Nếu ta tăng cao hơn nồng độ pectin trong môi trường (35, 40, 45 g/l), hoạt tính endo-polygalacturonase sẽ bị giảm đi rất nhiều so với những giá trị nồng độ pectin thấp hơn.
Hoạt tính endo-polygalacturonase thu được cao nhất khi hàm lượng pectin trong môi trường nuôi cấy ban đầu là 15g/l.
Bàn luận:
Ta nhận thấy kết quả thí nghiệm thu được phù hợp với quy luật ảnh hưởng của hàm lượng chất dinh dưỡng carbon lên quá trình sinh tổng hợp enzyme. Khi tăng hàm lượng pectin trong một khoảng giới hạn nhất định, lượng chất dinh dưỡng chứa carbon trong môi trường sẽ tăng. Do đó, nấm mốc sẽ sinh trưởng tốt hơn và quá trình sinh tổng hợp pectinase cũng được cải thiện. Pectin vừa là chất
dinh dưỡng carbon vừa là chất cảm ứng. Tuy nhiên, nếu ta tăng hàm lượng pectin vượt quá một giá trị giới hạn xác định, sẽ xuất hiện hiện tượng ức chế dị hóa (catabolite repression). Đó là do hàm lượng pectin trong môi trường nuôi cấy cao sẽ làm tăng hàm lượng các sản phẩm thủy phân pectin như a. galacturonic, oligogalacturonic… Sản phẩm thủy phân pectin có phân tử lượng thấp như a. galacturonic sẽ đóng vai trò là chất ức chế quá trình sinh tổng hợp pectinase ở nấm mốc.
Mặt khác, nấm mốc là vi sinh vật hiếu khí. Hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm mốc và quá trình sinh tổng hợp enzyme. Nếu hàm lượng pectin tăng cao sẽ làm cho độ nhớt của môi trường lớn, do đó hàm lượng oxy hòa tan vào môi trường sẽ giảm. Có lẽ đây cũng là một lý do làm giảm hoạt tính endo-polygalacturonase trong canh trường.