Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm:
Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu:
1.4.1.1. Giai đoạn 1: Chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp pectinase có
hoạt tính cao nhất
Mục đích:
Khảo sát động học quá trình sinh tổng hợp endo và exopectinase của 3 loài nấm mốc: A. oryzae, A. awamori, A. niger, sử dụng môi trường lỏng. Trên cơ sở đó:
Chọn ra loài nấm mốc cho pectinase (endo-enzyme) có hoạt tính cao nhất.
Chọn thời gian thích hợp cho quá trình nuôi cấy. Thực hiện:
Nuôi cấy 3 loài nấm mốc A. niger, A. oryzae, A. awamori trong môi trường có thành phần trình bày trong mục 3.1.4. Nhiệt độ nuôi cấy là 300C, thời gian nuôi cấy là 120 giờ. Cứ sau mỗi 12 giờ, ta lấy mẫu canh trường và xác định hoạt tính enzyme.
Để thu dịch enzyme từ dịch canh trường nuôi cấy, chúng tôi tách hệ sợi nấm bằng phương pháp lọc. Dịch enzyme sẽ được bảo quản ở – 200 C (nếu cần ).
1.4.1.2. Giai đoạn 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ
đến quá trình sinh tổng hợp pectinase:
(a)Thí nghiệm 1: Xác định hàm lượng pectin trong môi trường nuôi cấy:
Mục đích:
Xác định hàm lượng pectin (nguồn C và chất cảm ứng) trong môi trường nuôi để hoạt tính pectinase (endo-enzyme) thu được là cao nhất.
Thực hiện:
Thực hiện 9 mẫu thí nghiệm có thành phần môi trường được trình bày trong mục 3.1.4. Riêng hàm lượng pectin được thay đổi như sau (%w/v): 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5.
(b)Thí nghiệm 2: Chọn nguồn nitơ vô cơ cho môi trường nuôi cấy:
Mục đích:
Chọn ra nguồn nitơ vừa có giá thành rẻ, vừa giúp nấm mốc sinh tổng hợp pectinase (endo-enzyme) với hoạt tính cao.
Thực hiện:
Thực hiện 4 mẫu thí nghiệm, tương đương với 4 nguồn nitơ sau: NaNO3,
(NH4)2SO4, NH4Cl, (NH4)2HPO4.
Ở thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy có thành phần trình bày trong mục 3.1.4, tuy nhiên sử dụng hàm lượng pectin nhận được từ thí nghiệm 1. Hàm lượng các nguồn nitơ là 0,2% (w/v).
(c) Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy:
Mục đích:
Xác định hàm lượng nitơ thích hợp trong môi trường để nấm mốc phát triển và cho pectinase (endo-enzyme) có hoạt tính cao nhất.
Thực hiện:
Từ thí nghiệm 2, ta chọn được nguồn nitơ thích hợp. Sau đó chúng tôi thực hiện 5 mẫu thí nghiệm tương đương với hàm lượng nitơ trong môi trường nuôi cấy như sau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 %(w/v).
Các thành phần khác của môi trường được trình bày trong mục 3.1.4.
1.4.1.3. Giai đoạn 3: Tối ưu hóa hàm lượng nguồn carbon và nitơ trong
môi trường nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp pectinase bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm:
Mục đích:
Khảo sát sự ảnh hưởng đồng thời của hàm lượng pectin và hàm lượng nitơ trong môi trường nuôi cấy lên hoạt tính endo-polygalacturonase.
Thực hiện:
Chúng tôi thực hiện phương pháp trực giao bậc 2 để qui hoạch thực nghiệm. Ký hiệu: X1: hàm lượng pectin trong môi trường nuôi cấy (% w/v)
X2 : hàm lượng muối nitơ trong môi trường nuôi cấy (%w/v) Y: hoạt tính endo – polygalacturonase trong canh trường (UI/ml)
Chúng tôi xây dựng ma trận với 12 mẫu thí nghiệm (xem trang 47)
Sau khi thực hiện thí nghiệm, các số liệu thu được sẽ được xử lý để tính toán các hệ số của phương trình hồi qui.
Việc kiểm tra các hệ số phương trình phương trình hồi qui được thực hiện theo tiêu chuẩn Student.
Việc kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi qui với thực nghiệm được thực hiện theo tiêu chuẩn Fisher.
Dựa vào phương trình hồi qui thu được, chúng tôi rút ra kết luận về sự ảnh hưởng đồng thời của hàm lượng pectin và hàm lượng N lên hoạt tính endo- polygalacturonase trong canh trường nuôi cấy.
1.4.1.4. Giai đoạn 4: Thử ứng dụng chế phẩm pectinase thô thu được để
làm giảm độ nhớt của dịch quả:
Mục đích:
So sánh khả năng làm giảm độ nhớt nước ổi ép của chế phẩm pectinase của hãng Novo (Đan Mạch) với chế phẩm pectinase thô mà chúng tôi thu nhận được trong luận văn.
Thực hiện:
Lấy một lượng ổi nhất định đem nghiền nhỏ rồi ép lấy dịch nước ổi
Cho vào mỗi erlen 35 ml dịch ổi ép. Chúng tôi thực hiện 3 erlen tương ứng với 3 mẫu: mẫu I đối chứng (không bổ sung chế phẩm pectinase), mẫu II được bổ sung chế phẩm enzyme của Novo, mẫu III được bổ sung chế phẩm enzyme mà chúng tôi thu nhận.
Mẫu II và III được bổ sung các chế phẩm enzyme với cùng số đơn vị hoạt tính (0,0275UI/ml dịch quả).
Điều kiện để phản ứng: Nhiệt độ: 300C Thời gian: 30 phút
pH tự nhiên của dịch ổi là 4,42
Sau đó, ta so sánh mức độ giảm độ nhớt trong 3 mẫu thí nghiệm.