1.5.1.1. Hóa chất:
Dung dịch pectin 0,5% pha trong đệm acetate 0,1M; pH=4,5 Dung dịch ZnSO4 5% Dung dịch Ba(OH)2 10% Thuốc thử DNS, hỗn hợp gồm: Nước cất: 60-70ml NaOH rắn: 1,6g Acid dinitrosalicylic (DNS: C7H4N2O7): 1g Muối Seignette (C4H4O6KNa.4H2O): 30g
Khuấy tan hoàn toàn hỗn hợp bằng máy khuấy từ và định mức đến vạch 100ml bằng bình định mức. Thuốc thử được bảo quản trong chai nâu ở điều kiện lạnh (dung dịch dùng tốt trong khoảng 10-15 ngày).
Dung dịch acid monogalacturonic nồng độ 0,2%: hòa tan 0,2g monogalacturonic bằng nước cất và định mức đến 100ml.
1.5.1.2. Tiến hành:
Để thực hiện phản ứng thủy phân pectin bằng xúc tác enzyme pectinase, ta tiến hành như bảng sau:
Bảng 3.1: Thực hiện phản ứng giữa pectinase và cơ chất. Erlen Dung dịch pectin 0,5% pha trong đệm acetate (ml) Dịch emzyme (ml) Nước cất (ml) Kiểm chứng 35 0 5 Mẫu thí nghiệm 35 5 0
Sau thời gian phản ứng là 30 phút ở 450C, ta đem vô hoạt enzyme bằng cách nhúng các erlen trong bể điều nhiệt bằng nước ở 980C trong 5 phút, ta sẽ thu được dung dịch pectin đã phản ứng.
1.5.1.1. Xác định hoạt tính endo-polygalacturonase:
Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của endo-polygalacturonase, mạch pectin sẽ bị phân cắt nhỏ và độ nhớt của dịch pectin bị giảm đi. Dùng nhớt kế ta sẽ đo được độ giảm độ nhớt của dịch pectin.
Định nghĩa:
Một đơn vị hoạt tính của endo-polygalacturonase là lượng enzyme có khả năng thủy phân làm giảm 50% độ nhớt của dịch pectin có nồng độ 0,5% sau thời gian phản ứng là 30 phút ở 450C.
Cách thực hiện:
Cho dịch pectin kiểm chứng vào nhớt kế và đo thời gian chảy của nó. Thời gian chảy của dịch pectin kiểm chứng là t0.
Sau đó, ta cho dịch pectin đã phản ứng vào nhớt kế và đo thời gian chảy t của nó.
Công thức xác định hoạt tính endo-polygalacturonase:
n t t t Hd . . 50 100 ). ( 0 0 − = (1)
Hd: hoạt tính của endo-polygalacturonase, đơn vị là UI/ml. t0: thời gian chảy của dịch pectin kiểm chứng, đơn vị là giây.
t: thời gian chảy của dịch pectin bị thủy phân bởi enzyme, đơn vị là giây. n: thể tích dịch enzyme phản ứng, đơn vị là ml.
Vì thể tích dịch enzyme phản ứng là 5ml, nên ta thay n=5, và do đó ta có công thức: 0 0 . 25 ). ( t t t Hd = − (2)
1.5.1.2. Khảo sát hoạt tính exo-polygalacturonase:
Nguyên tắc:
Phương pháp quang phổ so màu dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa chất khử (monogalacturonic acid) với thuốc thử dinitrosalicylic acid. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ chất khử trong một phạm vi nhất định. Dựa vào phương trình đường chuẩn sẽ xác định được hàm lượng chất khử của mẫu thí nghiệm.
Trong nghiên cứu này, phương trình đường chuẩn được xây dựng dựa trên monogalacturonic acid, sử dụng bước sóng 540nm để xác định độ hấp thu.
Định nghĩa:
Một đơn vị hoạt tính của exo-polygalacturonase là lượng enzyme thủy phân dung dịch pectin 0,5% để cho ra 1 µmol monogalacturonic acid trong 1 phút ở 450C.
Dựng đường chuẩn monogalacturonic acid:
Từ dung dịch monogalacturonic nồng độ 0,2%, pha các dung dịch đường chuẩn với nồng độ lần lượt là 0; 0,25; 0,5; 1; 1,5 và 2 (mg/ml).
Bảng 3.2: Dựng đường chuẩn monogalacturonic acid Ống nghiệm Dung dịch monogalacturonic acid 0,2% (ml) Nước cất (ml) Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml) 1 0 1 0 2 1 7 0,25 3 1 3 0,5 4 2 2 1 5 3 1 1,5
6 1 0 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hỗn hợp giữa dung dịch monogalacturonic acid 0,2% và nước được lắc đều và ứng với từng nồng độ chuẩn, chúng tôi hút ra 1ml rồi thực hiện phương pháp so màu với 1ml DNS.
Cách thực hiện:
Hút ra 15 ml dịch pectin đã phản ứng và cho vào erlen tương ứng, sau đó thêm 1ml ZnSO4 5% và 1ml Ba(OH)2 vào, lắc mạnh rồi lọc tách bỏ kết tủa, thu phần dịch trong A.
Ta cũng làm tương tự với mẫu kiểm chứng.
Hút 1ml dịch trong A thu được cho vào từng ống nghiệm tương ứng rồi thực hiện phương pháp so màu với 1ml DNS.
Đo độ hấp thu:
Các dung dịch chuẩn và các mẫu sau khi cho DNS được đem đi đun cách thủy ở 1000C trong khoảng thời gian là 5 phút. Sau đó làm nguội nhanh dung dịch. Pha loãng dung dịch bằng 10ml nước cất, lắc đều đến khi dung dịch không còn phân lớp
Dung dịch được đem đi đo độ hấp thu ở bước sóng 540nm. Đối với các dung dịch chuẩn, sau khi đo độ hấp thu, ta lập được phương trình đường chuẩn.
Từ phương trình đường chuẩn, chúng ta xác định được hàm lượng monogalacturonic acid có trong mẫu nghiên cứu, do đó xác định được hoạt tính exo-polygalacturonase.
Công thức xác định hoạt tính exo-polygalacturonase:
n t M M He . . 194 1000 * ) ( − 0 = (4)
He: hoạt tính của exo-polygalacturonase, đơn vị là UI/ml. M: lượng chất khử có trong mẫu có enzyme (mg).
M0: lượng chất khử có trong mẫu kiểm chứng (mg). t: thời gian phản ứng, đơn vị là phút.
Trong thí nghiệm này, ta cho enzyme phản ứng trong 30 phút, với thể tích dịch enzyme cho vào là 5ml, nên ta có công thức:
5 . 30 . 194 1000 * ) (M M0 He = − (5)
1.5.1.3. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến:
Nguyên tắc:
Dùng protein casein làm cơ chất. Xác định hoạt độ phân giải protein của enzyme trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng với thuốc thử Folin-Cio-Calteau. Dựa trên đồ thị chuẩn, định lượng Tyrosin tương ứng với hàm lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme.
Định nghĩa:
Một đơn vị hoạt tính của protease là lượng enzyme có khả năng thủy phân protein tạo ra 1 µmol tyrosin trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ 300C.
Hoá chất:
Dung dịch Casein 1% pha trong dung dịch đệm 0,2N Glycin-NaOH pH 9,5.
Thuốc thử Folin
Dung dịch tyrosin 1mM: cân 18,12mg tyrosin, hòa tan trong nước cất và định mức đến 100ml.
Dựng đường chuẩn:
Từ dung dịch tyrosin 1mM, ta pha thành các dung dịch tyrosin có nồng độ như sau:
Bảng 3.3: Xây dựng đường chuẩn tyrosin:
Ống số 1 2 3 4 5 6 7 Dung dịch tyrosin 1mM (ml) 0 1 1 3 1 1 3 Thể tích nước cất (ml) 1 19 9 17 4 3 7 Nồng độ dung dịch chuẩn (µ mol/ml) 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
Tiến hành:
Ống 1: 0,8ml dung dịch Casein để 5 phút ở 300C, thêm 0,4 ml mẫu enzyme ở 300C trong 10 phút. Thêm 2ml TCA 5%. Ly tâm 10000 vòng/phút, 15 phút. Định lượng tyrosin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ống 2: 0,8ml dung dịch casein, cho vào 2ml TCA 5%. Thêm 0,4ml mẫu enzyme ở 300C. Ly tâm 10000 vòng/phút, 15 phút. Định lượng tyrosin.
Định lượng tyrosin:
ống 1: 2ml dung dịch NaOH 0,5N cho thêm 0,5ml mẫu, để 10 phút. Thêm 0,5 ml Folin, pha loãng 5 lần. Để yên 30 phút đo ở bước sóng 750nm.
Ống 2: 2ml dung dịch NaOH 0,5N cho thêm 0,5ml nước cất để 10 phút. Thêm 0,5ml Folin, pha loãng 5 lần. Để yên 30 phút, đo ở bước sóng 750nm
Hàm lượng tyrosin của mẫu được suy ra từ đường chuẩn. Tính toán kết quả:
Xác định phương trình đường chuẩn tyrosin. Xác định OD: mật độ quang của ống mẫu.
Xác định hàm lượng tyrosin từ phương trình đường chuẩn tyrosin. Xác định đơn vị hoạt tính của enzyme protease.
t V n V P P HP E hh * * * ) ( 1 − 2 =
HP: hoạt tính protease (UI/ml).
P1: số µmol tyrosin trong ống mẫu (ống 1).
P2: số µmol tyrosin trong ống kiểm chứng (ống 2). n: hệ số pha loãng.
Vhh: thể tích hỗn hợp phản ứng (ml). VE: thể tích enzyme phản ứng (ml). t: thời gian phản ứng (phút).